RAB1A在垂体腺瘤组织中的表达及临床意义

季欢欢 冯蒙蒙 李 靖 赵宗仁 董秋秀 郑金玉 陈中俊

垂体腺瘤（pituitary adenoma，PA）是颅内常见的良性肿瘤之一，约占颅内肿瘤的15%。部分PA 呈侵袭性生长，是临床治疗的一大难题，术后易复发。侵袭性PA的发生、发展是一个多因子参与、多因素相互作用的复杂过程，包括原癌基因激活、抑癌基因失活、细胞信号通路异常、染色体异常及血管生成因子改变等。Ras 相关蛋白Rab-1A（Ras-related protein Rab-1A，RAB1A）是一种高度保守的小鸟苷三磷酸酶，调节细胞内囊泡运输。有研究显示，RAB1A作为癌基因在多种肿瘤中发挥作用，包括结直肠癌、膀胱癌和鼻咽癌等。也有研究发现，胶质瘤组织RAB1A高表达，可通过上皮间质转化影响肿瘤细胞的增殖和侵袭。本文探讨RAB1A 在PA中的表达及其与肿瘤侵袭性的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集2018 年1 月至2021 年8 月手术切除的104 例PA 标本，其中男59 例，女45 例；年龄28～71岁，平均（49.07±10.32）岁；肿瘤直径8～49 mm，平均（28.01±8.51）mm；病理类型为混合型22 例，生长激素型13 例，泌乳素型25 例，促肾上腺皮质激素型10例，无功能型34例。根据Knosp分类法：侵袭性41 例，非侵袭性63 例。纳入标准：病理检查证实为PA；年龄≥18岁；术前未接受过放/化疗；病例资料完整。排除标准：合并感染；合并其他部位肿瘤；合并代谢性疾病；合并免疫性疾病。本研究经医院伦理委员会批准，病人或家属签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色法检测组织RAB1A 表达 组织经10%中性福尔马林（上海研生实业有限公司）固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片（厚度为4 μm）。检测前用二甲苯脱蜡，乙醇水化，柠檬酸钠抗原修复液（武汉博士德生物科技有限公司）进行抗原修复，随后用羊血清封闭。按照免疫组化SP 法检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）说明书操作。加兔抗人RAB1A 单克隆抗体（1:1 000，美国Sigma 公司），4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤后，滴加酶标羊抗兔抗体（美国Sigma公司）室温孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，最后中性树胶封闭，显微镜下观察。染色为棕黄色颗粒视为表达阳性（图1），随机选择10 个显微镜下视野，每个视野随机选100 个细胞，进行染色评分。染色强度的评分方法：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分：<5%为0分，5%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，>75%为4分。染色强度评分和阳性细胞比例评分相乘，≥4分为高表达。

图1 免疫组织化学染色法检测垂体腺瘤组织RAB1A的表达（SP法，×400）

1.3 免疫印迹法检测组织RAB1A 表达 随机选取12例侵袭性PA组织和12例非侵袭性PA组织，用RAPI裂解液（上海尚宝生物科技有限公司）提取总蛋白，用10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至PVDF（上海尚宝生物科技有限公司）。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人RAB1A 单克隆抗体（1:1 000倍，美国Sigma 公司）4 ℃过夜孵育，用TBST缓冲液洗涤3 次后，加入羊抗兔二抗（美国Sigma 公司）室温封闭1 h，ECL法进行蛋白成像，Image J软件分析灰度值。以β-actin作为内参。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0软件处理；计量资料以±

s

表示，用

t

检验；计数资料用

χ

检验；应用多因素logistic 回归模型分析侵袭性的影响因素；用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析RAB1A 鉴别PA 侵袭性的价值，计算曲线下面积、灵敏度和特异度；

P

<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PA 组织RAB1A 表达水平的变化 侵袭性PA 组织中RAB1A 高表达率[65.85%（27/41）]明显高于非侵袭性PA组织[36.51%（23/63）；

P

<0.05]。侵袭性PA组织RAB1A 蛋白相对表达量（2.87±0.54）明显高于非侵袭性PA组织[（1.67±0.48）；

P

<0.05；图2]。

图2 免疫印迹法检测垂体腺瘤组织RAB1A表达的电泳图

2.2 PA侵袭性生长的影响因素 单因素分析显示，肿瘤直径、RAB1A表达水平与PA侵袭性有关（

P

<0.05，表1）。多因素logistic回归分析显示肿瘤直径≥3 cm（OR=2.342；95%CI 1.003～5.903；

P

<0.001）、RAB1A高表达（OR=1.908；95%CI 1.004～3.786；

P

=0.003）是PA侵袭性生长的独立影响因素。

表1 垂体腺瘤侵袭性生长影响因素的单因素分析（例）

注：与非侵袭性组相应值比，*<0.05

危险因素性别侵袭性（n=41） 非侵袭性（n=63）男女年龄21 20 35 28≥60岁<60岁肿瘤直径≤1 cm 1～3 cm≥3 cm肿瘤囊性变病理类型无功能型ACTH型泌乳素型生长激素型混合型RAB1A表达高表达低表达9 32 25 38 07 34（82.93%）*7 18 32 13（20.63%）10 12 4 11 68 23 6 14 7 13 27（65.85%）*14 23（36.51%）40

2.3 ROC曲线分析结果RAB1A表达水平鉴别PA侵袭性生长的曲线下面积为0.851，灵敏度、特异度分别为85.13%和79.12%。见图3。

图3 ROC曲线分析RAB1A鉴别垂体腺瘤侵袭性生长的效果

3 讨论

临床上，部分PA 会侵袭周围组织，全切除较困难，术后易复发。近年来，越来越多研究开始关注侵袭性PA 的生物学标志物，包括影像学指标、病理学指标、分子生物学指标。RAB1A 是RAS 小G 蛋白家族成员之一，参与细胞增殖、侵袭、分化和凋亡等。有研究发现RAB1A 可通过IL-4R/JAK1/STAT6 信号通路促进非小细胞肺癌的侵袭。本文侵袭性PA组织RAB1A表达水平明显高于非侵袭性PA组织；多因素logistic回归分析显示，RAB1A是PA侵袭性生长的独立影响因素；ROC 曲线分析显示RAB1A 鉴别PA 侵袭性生长的曲线下面积为0.851，灵敏度、特异度分别为85.13%和79.12%。这提示RAB1A对评估PA的侵袭性有一定价值。

本研究也存在一些局限性，例如未分析RAB1A下游信号通路的变化；未分析RAB1A 与PA 增殖和凋亡的变化；未对病人进行随访，未能明确RAB1A与PA预后的关系。未来需要开展细胞和动物研究，深入分析RAB1A与PA的关系。

总之，RAB1A 的表达水平与PA 的侵袭性有关，检测RAB1A可辅助评估PA的侵袭性。