尿中肌酐检测方法的优化研究

梁先长 邓艳芹 田晟 程甲 吴天骄

（湘西自治州疾病预防控制中心 湖南 吉首 416000）

1 前言

肌酐是一种低分子量的含氮化合物，是磷酸肌酸通过脱磷酸基闭合成环的内脱水物[1]，临床上主要检测血肌酐和尿肌酐。血中肌酐浓度主要与肾小球滤过率相关，故血清肌酐的测定是常规肾功能试验之一，对于严重肾小球病变引起的肾功能不全、肾炎、尿毒症等的诊断具有重要意义[2]。尿肌酐的排出量能反映身体肌肉质量[3]，粗略判断24 h尿液收集的完整性[4]，还能够评估人群的蛋白质营养情况[5]。由于尿肌酐的排泄量稳定，有研究人员推荐采用尿肌酐浓度校正其他检测值[6]，郭晓慧[7]提出将24 h尿碘排出量的肌酐校正值作为评价学龄儿童个体和人群碘摄入量的指标。在尿液污染物、重金属研究[8]及估算尿液中农药等环境有害物质[9-10]，以及职业性汞中毒[11]和镉中毒[12]诊断标准中，都用到尿肌酐含量校正。

目前，测定尿肌酐的方法有苦味酸分光光度法[13]和反相高效液相法[14]。苦味酸分光光度法成本低廉、操作简便，最常用的现场测定方法，但是线性范围较小（0～1.0 g/L），而《职业性镉中毒的诊断》中明确规定对肌酐浓度小于0.3 g/L或大于3.0 g/L的尿样应重新留取尿样检测[12]，故需对部分样品进行稀释和二次测定，导致工作量增加。本文通过考察反应温度、反应时间、苦味酸加入量对尿中肌酐检测的影响，优化反应条件，建立一种检测范围广、快速准确的尿中肌酐检测方法，以期为标准方法的更新提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

尿样（湘西州职防所）；盐酸、氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚、肌酐（分析纯）。试剂配置参考WS/T97-1996尿中肌酐分光光度测定方法[13]。

2.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（UVmini-1280，配5 mm比色皿，日本岛津）；电子分析天平（HZY-AZZO，华志电子科技）；电热恒温水浴锅（DK-98-11A，天津市表斯特仪器）。

2.3 方法

2.3.1 反应时间的选择

选择肌酐浓度为1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，在20℃条件下，从反应时间15 min开始，每隔2 min测量反应溶液的吸光度值，考察反应时间对测量吸光度值的影响。

2.3.2 反应温度的选择

选择肌酐浓度为1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，分别在15、20、25、30、35、40、45℃条件下，反应30 min，考察反应温度对测量吸光度值的影响。

2.3.3 苦味酸加入量的选择

选择肌酐浓度为1.00 g/L，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃条件下，反应30 min，考察苦味酸加入量对测量吸光度值的影响。

配制6套肌酐浓度为0.00、0.10、0.20、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L的标准系列，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃条件下，反应30min，以吸光度为纵坐标，肌酐浓度为横坐标，绘制标准曲线，考察肌酐加入量对肌酐反应的影响。

2.3.4 正交优化试验

选择肌酐浓度为1.00 g/L测量吸光度值，综合单因素试验结果，选取反应时间、反应温度和苦味酸加入量3个因素，设计3因素3水平正交分析试验，试验设计因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平表

2.3.5 方法学考察

对方法的检出限、加标回收率和精密度进行考察。

2.4 分析评价

2.4.1 尿中肌酐的测定

肌酐标准溶液0.10 g/L：准确称取0.100 0 g肌酐（经110℃干燥2 h），溶于盐酸溶液；定量转移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，此溶液为1.0 g/L肌酐标准储备液；用水稀释成0.1 g/L标准溶液（置于冰箱内可保存1个月）。取10支10 mL的具塞比色管，按表2配制标准系列。

表2 肌酐标准系列的配制

同时，取尿样0.10 mL，置于10 mL具塞比色管中，加入纯水至3.0 mL；向各管中加入一定量碱性苦味酸溶液，纯水定容后充分摇匀，在一定温度下反应一定时间；以0管作参比，在490 nm波长处，用0.5 mm比色皿上机测定吸光度；以吸光度为纵坐标，肌酐浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.4.2 结果计算

C=c×f

式中：C——尿中肌酐的浓度（g/L）；c——由标准曲线上查得的肌酐的浓度（g/L）；f——尿样稀释倍数。

3 结果与分析

3.1 反应时间的选择

由图1可知，吸光度值随着反应时间的延长而升高，约30 min时吸光度值趋于平衡，故选取30 min为最佳反应时间。

图1 反应时间对吸光度值的影响

3.2 反应温度的选择

由图2可知，在15℃～40℃之间，吸光度值随着反应温度的升高而升高，温度超过40℃时，吸光度值随着反应温度的升高而降低，原因可能是温度过高时，苦味酸和肌酐的结合不稳定。在15℃～25℃之间，显色稳定，故选取20℃为最佳反应温度。

图2 反应温度对吸光度值的影响

3.3 苦味酸加入量的选择

由图3可知，吸光度值随着苦味酸加入量的增加而升高，在苦味酸加入量为2.0 mL时，吸光度值趋于平衡。苦味酸加入量在1.5～3.0 mL时，标准曲线的线性相关系数较好。苦味酸加入量在1.5 mL时，标准曲线斜率较小，较为平缓；苦味酸加入量2.0 mL与2.5 mL、3.0 mL相比，标准曲线斜率相差不大，故选取苦味酸加入量为2.0 mL。

图3 苦味酸对吸光度值的影响

3.4 尿中肌酐检测条件优化

反应时间、反应温度和苦味酸加入量的正交试验设计及数据处理结果见表3。

表3 正交试验设计及数据处理结果

由表3可知，影响尿中肌酐测定的主要因素主次顺序为C＞A＞B，即苦味酸加入量对尿中肌酐测定的影响最大，反应温度影响最小。最优化工艺组合条件为A2（A3）B3C3，即反应时间30 min（35min）、反应温度25℃、苦味酸加入量2.5 mL。由于试验中反应温度的影响最小，综合经济性和实际条件考虑，选取反应时间30 min、反应温度20℃、苦味酸加入量2.0 mL为最佳反应条件，此条件下制作的标准曲线见图4。

图4 不同苦味酸加入量标准曲线图

3.5 方法学考察

3.5.1 检出限

加入一定体积的0.10 g/L肌酐标准溶液，扣除空白值后，将吸光度为0.015所对应的浓度作为检出限，经换算得出该方法的检出限为0.01 g/L（取样体积为0.10 mL），结果见表4。

表4 检出限试验

3.5.2 方法精密度

取0.1 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L这3个浓度水平的样品，重复测定10次，相对标准偏差为0.85%～2.98%。结果见表5。

表5 精密度试验（n=10）

3.5.3 加标回收试验

由表6可知，低点加标的平均回收率为101.7%；中点加标的平均回收率为97.8%；高点加标的平均回收率为100.6%。可见低、中、高点的加标回收率均在95%～105%之间。

表6 加标回收率试验

4 结论

综上所述，苦味酸法检测尿中肌酐的最优条件为：加入苦味酸2.0 mL，定容后在20℃反应30 min；以零管为参比，采用5 mm比色皿，于波长490 nn下测定。结果显示，尿肌酐在0.1 g/L～3.0 g/L范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 9，检出限为0.01 g/L，RSD为0.85%～2.98%，加标回收率在95%～105%，表明该方法准确可靠。与WS/T 97-1996《尿中肌酐分光光度测定方法》相比，降低了检出限，扩展了检测范围，提升了检测质量和检测效率，可为标准方法的更新提供参考依据。