超高效液相色谱串联质谱法测定猪肝中克伦特罗的不确定度分析

陈旭晋 苑华宁 陆宇阳 周锋杰 曹佳

（苏州市农产品质量安全监测中心 江苏 苏州 215000）

1 前言

克伦特罗属于β受体激动剂，是一种常见的肾上腺素类神经兴奋剂，将其加入饲料中，可以明显促进动物生长，改善肌肉和脂肪的分配比率，提高瘦肉率，因此被称为“瘦肉精”。其易在动物的腹膜组织中累积，人类摄入含β-受体激动剂的动物组织会引起急性中毒，因此我国农业部明令禁止在动物生产中使用。但在利益驱动下，仍有部分养殖业者违规使用，故相关检测监管工作具有重要意义。

不确定度是判断检测结果是否真实有效的一个重要参考指标，检测机构在出具报告时，应当附上不确定度分析，以体现其能力水平[1-2]。目前，对克伦特罗的检测主要采用液质联用法[3-4]。本文参考JJF 11 35-2005《化学分析测量不确定度评定》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》，对本实验室液质联用仪测定猪肝克伦特罗的不确定度进行分析，从而更准确地反映猪肝中克伦特罗的含量，以期为市场监管提供更可靠的数据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸（色谱纯，美国霍尼韦尔公司）；盐酸克伦特罗对照品（纯度：99.4%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

2.2 仪器与设备

串联四极杆质谱系统（QTRAP 5500，美国AB SCIEX公司）；超高效液相色谱串联质谱仪（H_Class，美国Waters公司）；百分之一电子天平（BSA2202SCW，德国赛多利斯集团）；十万分之一电子天平（BT25S，德国赛多利斯集团）。

2.3 实验方法

2.3.1 标准溶液配置

精密称取盐酸克伦特罗对照品11.42 mg，置于100 mL容量瓶中；用甲醇溶解并稀释，即得浓度为100 μg/mL的标准储备液。

使用1 mL移液器量取100 μg/mL标准储备液1 mL，置于100 mL容量瓶中；用甲醇定容，即得1 μg/mL的标准中间液；量取1 mL标准中间液，置于100 mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，即得10 ng/mL标准工作液。

2.3.2 样品前处理

参照农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》4.4.1～4.4.4步骤进行操作。

2.3.3 测定条件

液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：40℃；进样量：10 μL；流动相：流动相A：0.1%甲酸乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸水溶液。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子化电压：5 500 V；温度：550℃。

3 结果与分析

3.1 建立数学模型

猪肝中克伦特罗含量按式（1）计算：

式中，x——试样中克伦特罗残留量（μg/kg）；c——试样溶液中克伦特罗的浓度（ng/mL）；V——溶解残余物所用溶液体积（mL）；m——试料的质量（g）；f（rec）——校正因子。

3.2 不确定度来源

根据数学模型，影响猪肝中克伦特罗含量的不确定度的来源主要有：称量样品、配置标准储备液和工作液、配置校准曲线溶液、样品均一性引入的不确定度等。

3.3 各个不确定度分量评定

3.3.1 称量样品引入的不确定度Urel（m）

（1）重复称量样品所产生的误差：重复称样6次，称样量分别 是2.01、2.01、2.01、2.00、2.00、2.01g，平均值为2.01 g，单次测量结果的标准不确定度以标准偏差表征，U（m1）=0.005 164 g。

（2）使用天平所产生的误差：查阅天平的检定证书可知，天平的测量不确定度为0.02 g（k=2）。试验中共使用天平2次，分别是天平去皮和猪肝样品称重，因此天平误差引起的不确定度0.014 1 g。故

3.3.2 标准储备液配置所产生的不确定度Urel（C）

（1）标准物质本身引起的不确定度：查阅标准物质的证书可知，其扩展不确定度为±0.2%（k=2），假设置信水平P=95%，则标准物质相对标准不确定度Urel（i）=0.001。

（2）固体标准品称量过程中产生的不确定度：查阅天平的检定证书可知，测量不确定度为0.03 mg（k=2），称样量为0.011 142 g，故称量过程中相对标准不确定度Urel（m3）=0.002 63。

（3）容量瓶定容产生的不确定度：查阅100 mL A级容量瓶检定证书可知，100 mL容量瓶引起的不确定度为0.018 mL（k=2），则U1（V1）=0.009 mL；实验室温度误差引起的不确定度，实验室温度为20±5℃，甲醇的温度膨胀系数为1.1×10-3，温度引起的不确定度为，用甲醇定容标准储备液的相对不确定度为Urel（V1）=0.003 18，配置标准储备液所产生的不确定度为Urel（C）=0.004 25。

3.3.3 标准工作液配置所产生的不确定度Urel（C-2）

标准工作液的配置过程引起的不确定度，主要来源于容量瓶定容和移液器移液所产生的不确定度。实验室温度为（20±5）℃，水的温度膨胀系数是2.1×10-4，温度引起的不确定度为U2（V2）=0.060 6 mL。故用0.1%甲酸水定容标准工作液的相对不确定度为Urel（V2）=0.000 632。查阅1 mL移液器检定证书可知，其扩展不确定度为0.54 μL（k=2），则U1（V1mL）=0.27 μL。由温度变化引起的不确定度为U2（V1mL）=0.003 18 mL，则Urel（V1mL）=0.003 19。已知，100 mL容量瓶引起的不确定度为U1（V1）=0.009 mL，用甲醇定容至100 mL的相对不确定度为Urel（V1）=0.003 18。则标准工作液配置过程所产生的不确定度为0.005 56

3.3.4 标准系列溶液所产生的不确定度Urel（std）

取匀浆后的空白样品2 g，置于50 mL离心管中，平行操作6次。分别向其中添加适量标准工作液，详见表1，按照“2.3”中的样品前处理步骤，得到空白添加标准系列溶液。

表1 克伦特罗标准系列溶液添加结果

由表1可知，100 μL移液枪的扩展不确定度为0.06 μL（k=2），则U1（V100μL）=0.03 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V100μL）=0.060 6 μL，则U（V100μL）使用2次，分别移取50 μL和100 μL，移取过程相互独立，故使用100 μL移液枪产生的相对标准不确定度

200 μL移液枪扩展不确定度为0.12 μL（k=2），则U1（V200μL）=0.06 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V200μL）=0.121 μL，则U（V200μL）=0.135 μL；使用1次，移取200 μL，故使用200 μL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V200μL）=0.000 675。

1 mL移液枪扩展不确定度为0.54 μL（k=2），则U1（V1mL）=0.27 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V1mL）=0.000 606 mL，则U（V1mL）=0.000 634；使用2次，分别移取0.5 mL和1.0 mL，且移取过程相互独立，故使用1 mL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V1mL）=0.001 42。

5 mL移液枪扩展不确定度为4 μL（k=2），则U1（V5mL）=2μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V5mL）=0.003 03 mL，则U（V5mL）=0.003 63 mL；使用1次，移取2 mL，故使用5 mL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V5mL）=0.001 82。

则配置克伦特罗标准曲线溶液过程所产生的不确定度为Urel（std）=0.002 84。

3.3.5 样品均一性产生的不确定度Urel（uni）

对于实验过程中由样品均一性等引起的不确定度，本文通过6次平行实验测量结果的平均值的标准偏差来衡量，结果见表2，故

表2 样品6平行实验测定结果

3.3.6 实验过程中其他因素引起的不确定度Urel（rec）

本文以回收率的形式，评价检测过程中样品提取不充分、样品净化过程中存在损失或污染、仪器不稳定及其他随机因素引起的不确定度。通过基质添加浓度为2.00 μg/kg，平行4份样品进行添加回收实验，计算回收率。

结果显示，回收率分别为84.5%、88.0%、94.0%、93.0%。取矩形分布，按公式计算，则b+=94%-100%=-6%，b-=100%-84.5%=15.5%，故Urel（rec）=0.027 4。

3.4 不确定度分量的合成

将所有产生不确定度的分量进行合成，得到猪肝中克伦特罗含量的总合成相对标准不确定度Urel==0.032。则相对扩展不确定度（置信概率95%，k=2）为：Urel×k=0.032×2=0.064。猪肝中克伦特罗测定结果为2.04 μg/kg，因此测量结果的扩展不确定度为：U=0.064×2.04=0.13 μg/kg。

综上所述，猪肝中克伦特罗含量测定结果表示为：w=2.04±0.13 μg/kg（置信概率95%，k=2）。

4 结论

本文通过建立数学模型对液质联用法测定猪肝中克伦特罗含量的不确定度进行分析，结果表明，样品提取效率、样品净化过程中的损失或污染、样品的均一性对检测结果的影响较大。应当规范检测流程，增加平行样品，定期检定仪器，以减少检测误差，提高结果准确度。