南四湖水体一种好氧反硝化细菌的分离与鉴定

王 磊 孙雪晴 周 晶

（1 东营市水务事业发展中心，山东东营 257091；2 曲阜师范大学，山东曲阜 273165）

南四湖是山东省内最大的淡水湖， 同时也是南水北调东线山东段主要调蓄水库， 是山东省重要的水源地。沿湖地区污染排放及湖内的水产养殖、航运等活动严重影响水质， 关乎沿湖居民的饮用水安全和南水北调东线的用水安全[1]。 近年来，南四湖的水体污染备受关注， 水体富营养化程度日趋严重。2010—2011 年枯水期期间， 南四湖湖区水位下降，水体溶解氧水平提高，总氮含量有所下降，说明该湖区的好氧反硝化细菌有较高效的反硝化作用[2]。 因此，对南四湖中的好氧反硝化细菌进行分离纯化、筛选及鉴定， 即可得到具有高效反硝化作用的好氧反硝化细菌菌株， 并且通过对南四湖中好氧反硝化细菌的分离筛选及研究， 能较准确地了解南四湖水体富营养化程度， 为今后降低其水体富营养化提供生物学方向的启示。

19 世纪80 年代人类首次分离出反硝化细菌，随后陆续发现了多种兼性厌氧的反硝化细菌[3]，例如丙酸杆菌属、克雷伯氏菌、螺旋菌属等。 随着科学技术的进步及发展，又发现了多种好氧反硝化细菌（逾50 个属130 个种），例如假单胞菌属[4]、施氏假单胞菌[5]、产黄杆菌[6]、无色杆菌属[7]、嗜碱副球菌[8]、副球菌属[9]等。目前，好氧反硝化细菌成为研究热点，人们重点关注好氧反硝化细菌的脱氮能力及在实际中的应用。反硝化细菌可以把电子传递给氧气，同时也能在硝酸还原酶的作用下传递给硝酸根[10]。 学者们也越来越多地将反硝化细菌与污水处理相结合， 并已经取得重大成果。反硝化细菌与水生态、水环境相结合的研究方向逐渐被关注， 并成为近年来人们的研究重点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1富集培养基。 NaNO30.85 g/L， 琥珀酸钠2.84 g/L，KH2PO41.36 g/L，MgSO4·7H2O 0.19 g/L，（NH4）2SO40.27 g/L， 酵母提取物1 g/L。 微量元素：FeSO4·7H2O 0.2 g/L，CoCl2·7H2O 1 g/L，Na2MoO4·7H2O 0.38 g/L，CaCl20.2 g/L，pH 值7.2[8]。

1.1.2分 离 培 养 基。 KNO31 g/L，KH2PO41 g/L，FeCl2·6H2O 0.5 g/L，CaCl2·7H2O 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，琥珀酸钠8.5 g/L，溴百里香酚蓝1%，乙醇溶液1‰，琼脂15 g/L，pH 值7.0~7.3[9-10]。

1.1.3反硝化培养基。 KNO30.6 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， 柠檬酸钠5 g/L，pH 值7.0[11]。

1.1.4LB 培养基。胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.2。

1.2 试验方法

1.2.1南四湖养殖水体的取样。 选取南四湖河蟹围网养殖区作为采样区[12-13]，采用五点采样法在河蟹围网养殖区采样。取样后立即带回实验室，并将其放入4 ℃冰箱中保存备用。将分离菌株接种在反硝化液体培养基上进行复筛， 即吸取培养液将其滴在干净的白瓷板上，加入Griess 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ，观察结果。若结果呈现红色， 则可证明含有亚硝态氮； 若显示无色， 且在加入二苯胺-硫酸试剂后生成了蓝色的沉淀，则可以证明含有硝态氮；若加入二苯胺-硫酸试剂后溶液依旧显示无色， 则证明无亚硝态氮和硝态氮的存在。

1.2.2反硝化菌株的鉴定。 生理生化鉴定参照常见细菌系统鉴定手册[5]。 用于16S rRNA 反应的引物为通用引物，正向引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′），反向引物为1492R（5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′）[14]。PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min；95 ℃变性35 s；56 ℃复性30 s；72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物由青岛派森诺生物科技有限公司进行测序。 测序结果，在NCBI 数据库中采用序列比对并构建出系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 形态特征

由图1 可知， 经筛选后的菌株S-5 在培养皿上的菌落呈现为微黄色，菌落表面湿润粗糙不透明，经革兰氏染色后显示为阳性。其细胞形态显示为杆状，有周生鞭毛。

2.2 分子生物学特征

经过PCR 扩增以及琼脂糖凝胶电泳后，得到菌株16S rDNA 序列的电泳图如图2 所示，其中，图片所显示的第5 列为目标菌株S-5 的结果， 除第1 列为Marker 外，其他均为对照。 在本试验中，所需目的片段大小约为1 500 bp。 之后经过测序可以得知，该片段的大小为1 422 bp。

将测序结果在NCBI 进行BLAST 比对后得知，目标菌株的序列跟蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的序列相似性极高，为99.93%，且与芽孢杆菌属中的3 株序列相似度达到了100%，这3 株序列的基因序号分别为MG787231.1、MK445142.1 以及KY312798.1。挑选序列相似度较高的菌株运用MEGA 6.1 软件，采用邻接法（neighbour-joining）制作系统发育进化树，其结果如图3 所示。 结合形态学分析及系统进化树的结果分析， 基本可以判定筛选出的菌株属于芽孢杆菌属，为蜡样芽孢杆菌。

3 结论与讨论

3.1 结论

从南四湖养殖水体采样， 采用富集培养得到反硝化细菌， 通过形态学观察、16S rRNA 基因序列分析及同源性比对，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌属，为蜡样芽孢杆菌。

3.2 讨论

近年来， 南四湖水体富营养化虽然处于较高水平，但较前几年有了极大程度的降低，南四湖水产养殖户也有投放益生菌的行为。因此，南四湖水体中可能含有大量的反硝化细菌， 通过对养殖水体中反硝化细菌的研究， 可得到后期解决南四湖富营养化的生物学方法。

本研究发现南四湖养殖水体中的反硝化细菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），属于芽孢杆菌属。经调查，南四湖区域应用的水产益生菌均为枯草芽孢杆菌，而蜡样芽孢杆菌致病性较强，可以从人工益生菌菌种中排除。反硝化细菌多在厌氧条件下生存，而芽孢杆菌属多在有氧或兼性厌氧的条件下生存， 该菌株的发现为南四湖富营养化水平的降低提供了一种好氧反硝化细菌的操作方式， 也为今后南四湖地区好氧反硝化细菌菌种筛选提供了一系列经验。Gatesoupe[15]研究表明，蜡样芽孢杆菌进入宿主体内能够迅速定殖，并可通过分泌蛋白酶和淀粉酶等大分子物质提高宿主的消化机能，促进营养物质的消化吸收。 孙 娜等[16]研究发现，蜡样芽孢杆菌具有产淀粉酶的特性， 试验组大菱鲆幼鱼肠道内消化酶活力的提高可能与该菌定殖于幼鱼肠道后分泌的胞外酶有关，其中淀粉酶、蛋白酶等胞外酶能够协助机体消化营养物质，促进饲料中营养素的降解，提高饲料利用率。 崔广鑫等[17]研究也表明，蜡样芽孢杆菌对大菱鲆幼鱼体内的抗氧化能力产生了积极影响。综上所述，蜡样芽孢杆菌有利于促进高等水生生物生长、 维持水体浮游生物生态平衡。

本研究确认了南四湖养殖水体中存在芽孢杆菌属，芽孢杆菌属是解磷菌的重要菌种，国内研究解磷菌已有100 多年历史。 Zeeuw[18]发现，某些难溶性的复合物施入土壤可作为磷源。 1948 年，Gerretsen[19]发现植物施不溶性磷肥，接种土壤微生物后，有利于磷吸收，从而促进植株生长。 有学者从土壤中分离出一种解磷巨大芽孢杆菌（B. megateriumvar.phosphaticum），其能分解核酸、卵磷脂，可提高土壤有效磷含量[20]。 尹瑞龄[21]从土壤中分离出265 株细菌，并测定了其溶解摩纳哥磷矿粉的能力，发现培养6 d 后，溶磷能力平均为2~30 mg/g，其中巨大芽孢杆菌、节杆菌、黄杆菌、欧文氏菌及假单胞杆菌解磷能力很强，达到25~30 mg/g。 Paul 等[22]发现，从豆科植物根际分离的几株芽孢杆菌溶解磷酸三钙效率较高，达18%。 陆洪省等[23]从黄河三角洲盐土中分离纯化了1 株具有高效解磷能力的菌株， 属于芽孢杆菌属， 与Bacillus thuringiensis同源性达98%。李 辉等[24]从蚯蚓粪分离筛选到7 株有解磷效果的菌株，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）解磷能力最强。 魏烈群等[25]从荣成天鹅湖沉积物中筛选出10 株有机解磷菌，溶磷圈直径比为1.05~4.11，均属于芽孢杆菌属（Bacillus）。 罗利均[26]通过紫外线—氯化锂诱导水体中采集的蜡状芽孢杆菌，变异筛选后活性磷浓度提高了29.3%， 磷酸钙发酵液中活性磷浓度提高了28.0%， 焦磷酸钙发酵液中活性磷提高了26.5%，同时变异菌产有机酸能力与植酸酶活性增强。

近10 年来，国内外研究表明，蜡样芽孢杆菌对重金属铬、镉、铅的耐受能力极强，变异菌株对重金属离子还原、吸附具有较强的能力。黄飞[27]研究表明，在重金属复合污染水体，Cu、Zn、Cd 和Pb 最高超标倍数分别达6 倍、20 倍、35 倍和3 倍，Cd 离子浓度高达150 mg/L 时蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）仍然可以生长。陈志[28]从铬渣中分离的蜡状芽孢杆菌具有耐受和还原Cr6+态离子团能力， 其细胞碎片和胞外分泌物都具有还原活性。另外，还证实了蜡状芽孢杆菌胞外分泌物能够与细菌竞争配位Cr3+离子。 李 辉等[29]从沈阳受镉污染土壤中筛选出高耐镉性蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），能够有效吸附Cd2+，且静电吸附、离子交换作用、表面配合作用是主要吸附机制。

本研究中， 经过一系列筛选分离操作得到的菌株在序列比对后， 发现与其他在含重金属锰的环境下分离出的菌株序列相似性极高， 表明该菌有很好的反硝化潜力， 这为蜡样芽孢杆菌的应用提供了新思路和新方向。因此，推测该菌株也有可能具有高抗锰的特性，与文献提到的蜡状芽孢杆菌高抗镉、铬特性相符， 为今后降低重金属地区富营养程度提供了研究思路， 并且为南四湖地区环境污染的防治提供了生物学方法。 南四湖水体及沉积物的芽孢杆菌属的反硝化能力、解磷能力以及芽孢杆菌生长对水体可溶性磷含量变化、C/P 值变化、藻类生长的影响都未见报道，有待进一步研究。