不同产地和采收期北青龙衣的生药学研究∗

王丽红 陈洁琳 闫勇杰 王 超 周 奇

（1. 佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2. 高密市人民医院，山东 高密 261599）

胡桃楸（Juglans mandshuricaMaxim.）的果实青皮可入药使用，名为北青龙衣（JM）[1]。《中华本草》和《中药辞海》记载，JM味苦性寒，具有清热、解毒、消肿、止痢、明目等功效[2-3]。JM在产地山区民间应用广泛，常将之泡茶或泡酒饮用，以用于治疗胃炎、胃痛、消化道癌症、细菌性痢疾、肠炎等疾病，且治疗效果显著[4-7]。此外，将胡桃楸鲜果皮捣汁外涂，在治疗上火头痛和神经性皮炎方面也有不错疗效[8]。传统生药学鉴定中最重要的方法之一是性状鉴定。随着产地和采收期的变化，仅仅依靠性状鉴定很难对同一品种的药材进行区分[9]。高效液相色谱（HPLC）法能快速地测定药材某一指标成分的含量[10-11]。近年来，虽然有学者从性状和显微方面对JM进行了初步的生药学鉴定，但无文献对其药材道地产地及最佳采收期进行报道，其药材的质量分析评价也缺乏依据[12-13]。

因此，本研究将对不同产地和采收期的JM进行生药学研究，通过对不同产地和采收期JM的药材质量进行评价，得出JM优质的道地产区及最佳采收期，为北青龙衣道地药材的质量评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用药材采自2016年7、8、9月，经鉴定均为胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）胡桃楸（Juglans mandshuricaMaxim.）的未成熟果实的干燥外果皮。药材的产地、采收期及编号见表1。外果皮剥下经35 ℃烘干48 h，粉碎机粉碎后过0.25 mm网筛备用。

表1 JM产地和采收期信息Tab.1 Information of origins and harvest times in JM

胡桃醌对照品（纯度≥98%），河南省标物生物科技有限公司；无水乙醇、乙醚、甲醇、磷酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；水合氯醛、甘油均为化学纯。

1.2 设备

生物显微镜（CX-33），日本奥林巴斯株式会社；双目解剖体视显微镜（XTS20-314A），北京泰克仪器有限公司；紫外可见分光度计（UV757），上海精密科学仪器有限公司；台式低速离心机（80-2），上海亚荣生化仪器厂；高效液相色谱仪（Agilent 1100 Series）、色谱柱（EclipseXDB-C18）、DAD检测器，美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 理化鉴定

1）样品溶液的制备：称取JM粉末2.00 g，加入90%乙醇30 mL，在30 ℃、300 W条件下超声提取40 min，过滤后3 500 r/min离心15 min，取上清液定容到10 mL容量瓶中[14-15]。在进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤。

2）色谱条件：色谱柱为EclipseXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水（55∶45），水相用磷酸（约0.1%）调pH为3.60；流速为1 mL/min；检测波长为248 nm；柱温为室温；进样量为10 μL[16-17]。

3）标准曲线确定：精密称量适量胡桃醌对照品，溶于甲醇，配制浓度分别为5.09、10.18、25.45、50.9、101.8、203.6 μg/mL的对照品溶液。按上述色谱条件进样，记录峰面积，以胡桃醌浓度（X）和峰面积（Y）进行标准曲线的绘制。

4）精密度测试：精密吸取25.45 μg/mL胡桃醌对照品溶液，连续进样5 次，记录每一次进样得出的峰面积，计算RSD值。

5）稳定性测试：精密吸取同一样品溶液，分别在0、3、6、12、24 h进样，测定其峰面积，计算RSD值[18]。

6）重复性测试：按样品处理方法制备5 份7 号样品溶液，重复进样5 次，测定峰面积，计算RSD值。

7）加样回收率测试：精密量取5.75 μg/mL的7 号样品溶液6 份，每份4 mL分别置于10 mL容量瓶中，依次加入1、2、3、4、5、6 mL浓度为20 μg/mL的对照品溶液，并用甲醇分别定容至刻度线，按上述色谱条件进行胡桃醌含量，计算平均回收率和RSD值。

1.3.2 性状鉴定

采用直观观察法观察1～9 号JM，观察其形状、色泽、质地、表面特征等；嗅闻其气味等；用尺测量其大小；采用水试（将JM浸泡于25 ℃水中0.5 h后观察溶液颜色）方法进行其他性状特征的观察，记录各数据，并进行对比[19-20]。

1.3.3 显微鉴定

取胡桃醌含量最高的样品，按常规石蜡切片法制作切片，番红50 %乙醇溶液-固绿95 %乙醇溶液染色，加拿大树胶封固[21-23]；取少量JM粉末，滴加1～2 滴水合氯醛透化制作临时装片[9]。每个样品制作切片30～50份[24]。置于显微镜下观察显微特征，并用显微量尺测量大小。

2 结果与分析

2.1 理化鉴定结果

2.1.1 方法学考察结果

胡桃醌回归方程Y=38.10X-172.6，r=0.999 1，表明胡桃醌的峰面积在5.09～203.6 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。精密度、稳定性、重复性、加样回收率的RSD值分别为2.01%、1.14%、1.89%、99.39%，表明仪器精密度良好、样品溶液于24 h内稳定性良好、此方法重现性良好且准确度较高。

2.1.2 不同JM胡桃醌的含量比较

同产地JM中胡桃醌含量均为9月˃8月˃7月；同采收期JM中胡桃醌含量为黑龙江产地˃吉林产地˃辽宁 产地（表2）。

表2 不同产地和采收期JM的胡桃醌含量比较Tab.2 Comparison of juglone content in JM from different regions and harvest times

2.2 性状鉴定结果

不同JM的性状特征如表3所示。黑龙江省产的JM果皮较吉林、辽宁大，外表面、毛茸和水试溶液颜色最深，质地硬而脆，口尝有辛辣感；吉林省产的外表面颜色偏黄，内表面可见脊棱线，质地坚韧，口尝发涩；辽宁省产的外表面颜色偏绿，毛茸和水试溶液颜色最浅，内表面可见脊棱线和黄色近粉末状物质，质地坚硬。

表3 不同JM的性状特征比较Tab.3 Comparison of macroscopical characteristics of different JM

2.3 显微鉴定结果

2.3.1 组织构造

JM组织特征如图1和2所示。外果皮为一列厚度为9～15 μm的细小类圆形表皮细胞，外被角质层，厚度6～9 μm，密生腺毛和非腺毛。腺毛头部由4～5个细胞组成，腺柄由5～7个细胞组成；非腺毛呈分枝状。气孔突出于表皮。中果皮较厚，厚度达1 200～2 300 μm，中果皮外侧的数列细胞，类圆形，细跑壁增厚，排列紧密；其他细胞多为类圆形薄壁细胞，薄壁细胞中含颗粒状叶绿体，偶见细小的草酸钙方晶。在中果皮的薄壁组织中可见外韧型维管束及散在的分泌细胞。中果皮再向内常有2～3列石细胞组成的石细胞环带。石细胞各异，有类圆形、椭圆形、多角形等。

图1 JM横切面部分详图（10×40）Fig.1 Partial detail of transverse section of JM (10×40)

图2 JM组织构造部分简图（10×10）Fig.2 Partial sketch of transverse section of JM (10×10)

图3 JM粉末特征图（10×40）Fig.3 JM powder characteristic diagram (10×40)

2.3.2 粉末特征

不同产地和采收期JM粉末特征如图3所示，特征信息统计表见表4，粉末特征大小统计见表5，粉末特征数量统计如图4所示。黑龙江省产的1号非腺毛、分泌腔最多；3号的石细胞最大，分泌细胞数量最多。吉林省产的石细胞较小，而6号腺毛最长，但数量微少。辽宁省产的8号石细胞数量最多，但较小；9号非腺毛较其他产地长，但非腺毛数量最少。各产地和采收期粉末的显微特征数量上各有所长，但随果实生长发育，3个产地的粉末特征大小均呈递增趋势。

图4 JM粉末特征数量统计图Fig.4 Quantitative statistical chart of JM powder characteristics

表4 不同产地和采收期JM的粉末特征统计表Tab.4 Statistical table of powder characteristics of JM in different origins and harvest times

表5 JM粉末特征大小统计表Tab.5 Statistical table of JM powder characteristic size

3 结论

胡桃醌为5-羟基-1,4-萘醌，属萘醌类化合物，具有止血、抗菌、抗肿瘤和抗病毒等活性[25-26]。胡桃醌作为北青龙衣的重要化学成分，其含量可作为筛选北青龙衣最佳产地和采收期的主要依据。

本研究表明，黑龙江省9月中下旬采收的北青龙衣含量最高，达203.476 μg/g。各产地和采收期北青龙衣的组织构造特征差异不大。黑龙江省9月中下旬采收的北青龙衣的性状鉴别点是果皮直径4.2～6.3 cm，外表面黑褐色，毛茸棕黄色，质地硬而脆，味辛，水试溶液棕黑色；粉末特征鉴别点是薄壁细胞排列紧密且内含液泡，石细胞壁增厚、腔内呈浅棕色、纹孔呈分枝状及层纹不明显，腺毛长直且颜色较深，分泌组织散在。