基于质量源于设计（QbD）理念的黄芪甲苷PLGA纳米粒制备工艺研究

李姿锐，王一婷，兰 帆，周素华，李 雅

基于质量源于设计（QbD）理念的黄芪甲苷PLGA纳米粒制备工艺研究

李姿锐，王一婷，兰 帆，周素华，李 雅*

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

基于质量源于设计（QbD）理念优化黄芪甲苷PLGA纳米粒的处方配比及制备工艺。采用乳化溶剂挥发法制备黄芪甲苷纳米粒。以黄芪甲苷纳米粒的包封率、载药量、粒径大小以及PDI计算总评归一值（OD值）为评价指标，首先应用Plackett-Burman实验设计筛选出对黄芪甲苷纳米粒性质影响显著的工艺变量，然后对筛选出的变量应用星点设计-效应面法进一步优化，并对其进行表征评价，考察纳米粒的体外释药行为。基于QbD理念，通过星点设计-效应面法对关键工艺参数（CPPs）进行优化，得到的最优处方总投药量为5.03 mg、泊洛沙姆浓度为0.48%、W/O体积比为14.33∶1。经验证黄芪甲苷纳米粒的包封率为（68.86±2.90）%，载药量为（4.78±0.45）%，粒径为（112.87±4.69）nm，PDI为0.134±0.010，ζ电位（−29.77±1.40）mV，且纳米粒呈圆球形，粒子均匀分散，未见粘连聚集，通过体外释放实验得知，纳米粒体外释药规律符合Riger-Peppas释药方程模型。基于QbD理念，得到了优化模型的产品，符合预期的QTPP质量稳定、可控，精度高，预测效果较好，制备工艺稳定可行。

黄芪甲苷；纳米粒；质量源于设计理念；Plackett-Burman；星点设计-效应面法；体外释放

缺血性心脏病是一种具有高发病率和高致死率的疾病，病理学定义为心肌细胞因供求灌注失衡长期缺血而死亡，目前尚无有效的临床治疗方法[1-2]。从中草药中分离高效低毒活性成分，用于心肌梗死防治，是中药领域治疗心血管疾病的一个研究热点。其中黄芪甲苷是从豆科黄芪属植物黄芪中分离得到的一种生物活性最好的皂苷类化合物。药理学研究显示，黄芪甲苷对心血管系统主要有治疗心力衰竭、耐缺氧、保护缺血心肌损伤等药理作用[3-4]。但黄芪甲苷存在水难溶性，相对分子质量相对较高，脂溶性低，渗透性较低，体内生物利用度低，心肌细胞对该活性成分摄取量也较低，使其使其在临床应用中受限。因此，亟需构建一种新型的载药系统，以提高黄芪甲苷的心肌细胞摄取量，并递送到心肌细胞线粒体，这很大程度可提高其治疗缺血性心脏病的疗效。

在此基础上，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly[lactic-co-glycolic acid]，PLGA］为载体材料包载黄芪甲苷，PLGA通常由来源广泛的乳酸和羟基乙酸开环缩聚得到，合成容易，性能稳定，且在体内自身的降解产物无刺激性、无毒害，因而该高分子材料表现出良好的生物可降解性和生物相容性。其还可通过增强药物的细胞摄取能力，提高纳米粒的抗心肌细胞缺血等作用。

质量源于设计（quality by design，QbD）是以预先设定的目标产品质量特性（quality target product profile，QTPP）为研发起点，如以缓控释制剂的体外释放度为质量控制指标，在了解关键物质属性和关键工艺参数基础上，建立质量风险管理，确立质量控制策略和药品质量体系[5-8]。本实验将黄芪甲苷PLGA纳米粒的处方工艺优化与QbD理念相结合，从设计层次保证药品质量，为抗心肌缺血的临床治疗思路提供新的选择。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱，美国安捷伦公司；Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm×4.6 nm，5 μm），大连依利特分析仪器有限公司；ZNCL-G智能数显磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；SCIENTZ-10N普通型冷冻干燥机，新芝冻干设备有限公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析仪，马尔文仪器有限公司；Tecnai G2 Spirit TWIN透射电子显微镜（TEM），FEI公司；Nicolet-iS5傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪，美国Thermo Fisher公司。

1.2 材料

泊洛沙姆188，批号113H022，Solarbio公司；PLGA，济南岱罡生物工程有限公司；丙酮，湖南汇虹试剂有限公司，批号20200917；原料药黄芪甲苷，批号C15735034，质量分数98%，上海麦克林生化科技有限公司）；对照品黄芪甲苷，质量分数98.5%，批号AF20050252，成都埃法生物科技有限公司；HPLC用试剂均为色谱纯。其余相应的试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 建立黄芪甲苷PLGA纳米粒的QTPP与关键质量属性（critical quality attributes，CQA）

通过相关研究文献的调研[9-10]，结合前期药理实验，确定本制剂的剂型设计、规格、包装形式等，建立了黄芪甲苷PLGA纳米粒的QTPP，见表1。根据表1中黄芪甲苷PLGA纳米粒的QTPP，结合前期预试验的经验，识别建立本制剂的CQA，结果见表2。

表1 黄芪甲苷PLGA纳米粒QTPP

2.2 黄芪甲苷PLGA纳米粒的制备

精密称取处方量的黄芪甲苷和处方量的PLGA（75∶25）于西林瓶中，加入2 mL有机溶剂（丙酮-无水乙醇1∶1），超声使PLGA完全溶解。制备0.4%泊洛沙姆188水溶液作为水相。将有机相和水相放入70 ℃水浴，有机相澄清后在1200 r/min、70 ℃下注入水相中，后调转速600 r/min，待有机溶剂挥干，冷却至室温，过0.22 μm微孔滤膜，即得。同样方法制备不含药物的空白纳米粒样品。

2.3 黄芪甲苷PLGA纳米粒中黄芪甲苷的测定

2.3.1 供试品溶液的配制 取按照“2.2”项下方法制备的黄芪甲苷纳米粒混悬液于10 mL量瓶中，用乙腈超声破乳后定容至刻度线，即得供试品溶液。

2.3.2 阴性对照溶液的配制 取按照“2.2”项下方法制备的空白纳米粒1 mL于10 mL量瓶中，用乙腈超声破乳后定容至刻度线，即得阴性溶液。

表2 黄芪甲苷PLGA纳米粒CQA识别

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品10.0 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得质量浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。

2.3.4 色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 nm，5 μm）；以乙腈-水（35∶65）为流动相，进样量20 μL；柱温40 ℃；蒸发光散射检测器检测；ELSD参数：漂移管加热温度设为65 ℃，增益60，气压275.79 kPa（40 psi），动力级别60%。

2.3.5 专属性考察 分别取黄芪甲苷PLGA纳米粒供试品溶液、对照品溶液以及阴性溶液，过0.22 μm微孔滤膜，在“2.3.4”项色谱条件下进行HPLC测量。由图1可知，黄芪甲苷混悬液与对照品溶液相比在相同的保留时间处出现色谱峰，空白纳米粒样品溶液未出现色谱峰，故认为空白纳米粒对实验无干扰作用。

2.3.6 线性关系考察 取“2.3.3”项下的黄芪甲苷对照品溶液，用甲醇配制成质量浓度分别为5、10、25、50、200、500 μg/mL的系列对照品溶液，以质量浓度的对数为横坐标（），峰面积的对数（）为纵坐标作图，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程＝1.265 8＋1.712 9，＝0.999 5，结果表明黄芪甲苷在5～500 μg/mL呈良好的线性关系。

图1 黄芪甲苷对照品(A)、黄芪甲苷PLGA纳米混悬液(B)、空白纳米粒(C) HPLC图谱

2.3.7 精密度试验 取低、中、高（5、50、500 μg/mL）3个质量浓度的黄芪甲苷对照品溶液，在“2.3.4”项色谱条件下进样测定，每一质量浓度测定6次，记录其峰面积，计算精密度。结果表明黄芪甲苷峰面积RSD值为1.32%，说明该方法的精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取“2.3.1”项下供试品溶液，按照“2.3.4”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24 h进样分析，计算得黄芪甲苷的峰面积RSD值为0.85%，说明所制备的纳米粒稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 按“2.3.1”项方法制备供试品溶液6份，按“2.3.4”项下色谱条件进行，计算得黄芪甲苷质量分数的RSD值为1.57%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 精密量取1 mL“2.3.1”项下供试品溶液9份，分为3组，分别加入黄芪甲苷对照品溶液，得到加样质量浓度分别为低、中、高（5、50、500 μg/mL）的溶液，按“2.3.4”项下色谱条件进行，计算回收率和RSD，测得加样回收率分别为98.78%、98.82%、102.64%，RSD均小于2.0%，结果表明该方法符合测定要求。

2.4 黄芪甲苷PLGA纳米粒的包封率和载药量的测定

2.4.1 包封率的测定 量取5 mL体积的黄芪甲苷纳米粒混悬液装入透析袋中，将其浸入到80 mL 40%乙醇溶液的释放介质中，在25 ℃，300 r/min恒温搅拌。分别于透析15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、300、360、420 min取透析介质60 mL，浓缩至5 mL，过0.45 μm微孔滤膜，进样分析。由图2可知，随着透析时间延长，透析介质中游离黄芪甲苷的含量一直增加，60～90 min，透析出的黄芪甲苷呈现平衡趋势，而后透析介质中游离黄芪甲苷骤然增多，说明外部的透析介质对透析袋内部纳米粒的形态开始破坏，从而使得纳米粒包封好的黄芪甲苷透析出来，因此最终确定透析时间为90 min。在“2.3.4”项色谱条件下进样测定，计算游离药量（游），并精密移取黄芪甲苷PLGA纳米粒供试品3.0 mL，加入乙腈破乳，超声，静置过夜，计算总药量（总）。

包封率＝(总－游)/总

2.4.2 载药量的测定 精密移取3 mL黄芪甲苷PLGA纳米粒置于已干燥至恒定质量的称量瓶中，冷冻干燥［温度−50 ℃，压强133.3 mPa（1 mTorr）］48 h，得到冻干粉净质量（冻干粉净质量），将冻干粉按照“2.3.1”项下供试品溶液处理方法处理后进样，测定冻干粉中的总药量（冻干粉总药量），计算载药量。

图2 透析平衡图

载药量＝冻干粉总药量/冻干粉净质量

2.5 Plackett-Burman实验设计筛选变量

通过对黄芪甲苷PLGA纳米粒处方及制备工艺的分析，以总投药量（1）、PLGA与药物质量浓度比（2）、泊洛沙姆质量分数（3）、制备温度（4）、W/O体积比（5）、磁力搅拌速度（6）为考察对象，以包封率（1）、载药量（2）、粒径（3）以及PDI（4）为评价指标，利用Plackett-Burman实验设计筛选出对黄芪甲苷纳米粒性质影响较显著的因素。因素水平、筛选试验安排及结果见表3。由Pareto图（图3）可知，泊洛沙姆质量分数以及W/O体积比对黄芪甲苷PLGA纳米粒粒径有显著影响（＜0.05）；总投药量对黄芪甲苷纳米粒的PDI有显著影响（＜0.05）；泊洛沙姆质量分数对黄芪甲苷PLGA纳米粒的载药量有显著影响（＜0.05）；而黄芪甲苷PLGA纳米粒的包封率模型值大于0.05，说明模型无显著性差异，故不进行分析。因此固定PLGA与药物质量浓度比、制备温度以及磁力搅拌速度不变，采用总投药量为3～7 mg，泊洛沙姆质量分数0.3%～0.7%，以及W/O体积比8∶1～18∶1，应用星点设计-效应面法（central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）进一步优化。

2.6 CCD-RSM优化黄芪甲苷PLGA纳米粒处方

2.6.1 试验设计 结合上述Plackett-Burman实验结果，发现总投药量（1），泊洛沙姆质量浓度（3），以及W/O体积比（5）对处方成型的影响较大，故选择其作为考察因素进一步进行处方优化。设计5水平（−2、−1、0、+1、+2），以包封率、载药量、PDI以及粒径4个分指标的总评归一值（overall desirability，OD）为总评价指标。计算公式为OD＝(12…d)1/k，为指标数。对取值越大越好的因素（包封率、载药量）和取值越小越好的因素（粒径、PDI）采用Hassan方法分别进行数字转换求归一值max和min[11-12]。具体因素水平及试验结果见表4。

表3 Plackett-Burman实验设计与效应值

图3 黄芪甲苷PLGA纳米粒粒径(A)、PDI (B) 和载药量(C) 的Pareto图(α＝0.05)

max＝(Y－min)/(max－min)

min＝(max－Y)/(max－min)

表4 CCD-RSM试验设计方案及响应值

2.6.2 模型拟合及方差分析 采用Design-Expert软件，以OD值对1、3、5进行二次多项式回归方程拟合。二次多项式回归方程为OD值＝−3.10－0.121＋14.313＋0.065－0.6313＋0.0315＋0.1935－2.9912－13.3032－9.6552。方差分析结果（表5）表明，回归模型＜0.05，失拟项水平不显著（＞0.05），说明模型拟合良好；回归方程拟合决定系数（2）为0.907 8，校正决定系数（2adj）为0.824 8，说明该模型可以解释82.48%的响应值的变异，且方程拟合程度较好。另外，总投药量（1）和W/O体积比（5）对OD值均具有显著影响（＜0.05），各因素之间不存在交互作用。以OD值对交互因素的响应面3D效果图见图4。

2.6.3 响应面优化 利用Design-Expert软件对上述所建立的数学模型进行综合分析，最终确定了各因素的最佳取值：总投药量为5.03 mg、泊洛沙姆质量分数为0.48%、W/O体积比为14.33∶1。对优化后的制剂处方进行验证试验，实测值和预测值较为吻合，相对偏差低于2.0%，说明预测结果准确可靠，见表6。黄芪甲苷粒径分布与ζ电位图见图5，其ζ电位分布在−35～−15 mV，属于纳米给药系统的稳定体系。

表5 CCD-RSM试验设计回归模型方差分析

图4 各因素间交互作用的响应面图

表6 验证结果(n = 3)

2.7 黄芪甲苷PLGA纳米粒的表征

2.7.1 纳米粒稳定性考察 将制备的黄芪甲苷纳米粒混悬液分别保存于4 ℃冰箱与室温（温度为20～25 ℃）条件下，分别在0～9 d定时取样测定其平均粒径及PDI大小变化，考察其稳定性。结果见表7。4 ℃时，平均粒径和PDI变化不大；室温时，平均粒径和PDI有上升趋势。因此，黄芪甲苷纳米粒4 ℃储存时质量稳定。

2.7.2 纳米粒形态学观察 称取适量黄芪甲苷纳米粒混悬液，滴至载玻片上，以2%磷钨酸负染后转移至专用铜网上，挥干，透射电镜下观察粒径形态和大小并拍照，所得结果见图6。结果可见纳米粒呈完整圆球形，且均匀分散，未见粘连聚集现象。

图5 黄芪甲苷PLGA纳米粒的粒径分布(A) 以及ζ电位 (B) 图

表7 4 ℃和室温下黄芪甲苷PLGA纳米粒的稳定性(n = 3)

图6 黄芪甲苷PLGA纳米粒的TEM图

2.7.3 黄芪甲苷的FT-IR分析 本实验采用红外光谱仪对各样品的表面化学结构进行检测。在室温下，采用4000～400 cm−1范围扫描，测定样品的红外吸收峰。FT-IR结果显示（图7），PLGA（50∶50）的C＝O酯键的伸缩振动峰出现在1 757.94 cm−1处，2 887.91 cm−1为PLGA的C-H键的伸缩振动峰；在黄芪甲苷原料药的红外谱图中，3 383.65 cm−1处为-OH的伸缩振动峰，结合1 112.93、1 069.41、1 048.17 cm−1，为多糖类羟基特征峰；而黄芪甲苷的红外光谱，与空白纳米粒的红外谱图相比较没有发生较大的变化，没有红外特征峰的出现，表明药物被成功包裹到材料中。因此，黄芪甲苷对纳米粒的微观结构并不构成影响。

2.8 黄芪甲苷PLGA纳米粒的体外释放

约10 cm的透析袋，置于蒸馏水中，煮沸20 min，浸泡24 h，再用蒸馏水润洗，备用。精密量取制得的黄芪甲苷纳米粒适量放于透析袋中，将口封紧，再将其置于磁力搅拌器上，另取黄芪甲苷原料药溶液放于透析袋中，设定转速为100 r/min，温度37 ℃，溶出介质为40%乙醇溶液80 mL，分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h时间点取样，将不同时间取得的溶出液采用“2.3.2”项下色谱条件进行HPLC法测定黄芪甲苷的量，并计算各时间点黄芪甲苷的累积溶出量，结果见图8和表8。结果表明，黄芪甲苷12 h时累积溶出为83.21%，而黄芪甲苷PLGA纳米粒释药较慢，12 h时累积溶出57.59%，因此黄芪甲苷PLGA纳米粒具有一定的缓释效应。

图7 空白纳米粒(A)、黄芪甲苷PLGA纳米粒(B)、黄芪甲苷原料药(C)的FT-IR检测图谱

从表8拟合模型来看，2越接近1，表明拟合效果越好，结果表明黄芪甲苷PLGA纳米粒在40%乙醇溶液中72 h内的累积释放符合Ritger- Peppas模型，2＝0.959 6，说明纳米粒释放机制为骨架溶蚀；黄芪甲苷原料药累积释放符合一级模型，2＝0.981 3，说明原料药的释放为等比扩散为主。

3 讨论

载体包封药物的常规制备方法主要有纳米粒沉淀法、乳化溶剂挥发法、高压均质法、微乳法等。本实验曾采用纳米粒沉淀法和高压均质法制备纳米粒，结果大量的药物以白色沉淀析出，纳米粒粒径较大，PDI较高。采用改良的乳化溶剂挥发法时，所制备的纳米粒混悬液带有淡蓝色乳光，粒径分布均匀，稳定性较好，而且纳米粒的包封率和载药量得到了提高，同时，该法操作简单，重复性较好。

图8 体外释放曲线

表8 黄芪甲苷纳米粒的释药动力学拟合方程及相关系数[13-14]

本实验采用QbD理念，以治疗缺血性心脏病的口服聚合物纳米颗粒为预先设定的目标产品，设计其质量特性作为研究的基础，在系统了解关键物料属性和关键工艺参数的基础上[15-17]，结合Plackett- Burman及星点设计-效应面法进行实验设计，系统研究了纳米粒处方及生产工艺中的各参数，确定了黄芪甲苷纳米制剂最优处方组成及制备工艺。

星点设计-效应面优化法是当前常用的实验优化方法，通过非线性数学模型绘制效应面并优选最佳条件，能够保证试验精度，分析各因素之间的相互作用，具有显著减少实验次数、精度高、预测性较好等特点，避免了从实验室研究到工业生产过渡过程中生产工艺的单一性和不一致性[13,18-20]。星点设计时，当采用多指标优化实验，各指标的优选条件可能会相互矛盾，即对某一指标有利的条件可能对其他指标不利，这时可采用综合指标OD值来考察指标的综合效果。本实验采用星点设计3因素5水平制备黄芪甲苷纳米粒，以OD值作为综合指标优化黄芪甲苷纳米粒的最佳配比，优化后的纳米粒粒径小、包封率载药量高和稳定性均较好，为后期治疗缺血性心脏病的制剂开发奠定了理论基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on preparation process of astragaloside IV PLGA nanoparticles based on quality by design (QbD)

LI Zi-rui, WANG Yi-ting, LAN Fan, ZHOU Su-hua, LI Ya

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To optimize the formulation ratio and preparation process of astragaloside IV PLGA nanoparticles based on quality by design (QbD).Astragaloside IV nanoparticles were prepared by emulsification solvent evaporation method. Taking the encapsulation efficiency, drug loading, particle size and PDI calculated overall desirability (OD) of astragaloside IV nanoparticles as evaluation indicators. Plackett-Burman design was used to screen out the process variables that had a significant effect on the properties of astragaloside IV nanoparticles, and then the selected variables were further optimized by central composite design-response surface methodology, and were characterized and evaluated to investigate thedrug release behavior of nanoparticles.Based on QbD, the critical process parameters (CPPs) were optimized by central composite design-response surface methodology, and the optimal prescription dosage was 5.03 mg, the poloxamer concentration was 0.48, and the W/O volume ratio was 14.33:1. It was verified that the encapsulation efficiency of astragaloside IV nanoparticles was (68.86 ± 2.90)%, the drug loading was (4.78 ± 0.45)%, the particle size was (112.87 ± 4.69) nm, the PDI was 0.134 ± 0.010, the ζ was (−29.77 ± 1.40) mV, and the nanoparticles were spherical, the particles were uniformly dispersed, and there was no adhesion and aggregation. Release experimentshowed that the drug release rule of the nanoparticles conformed to the Riger-Peppas model.Based on QbD, the product of the optimized model is obtained, which meets the expected QTPP and has stable and controllable quality, high precision, good prediction effect, and stable and feasible preparation process.

astragaloside IV; nanoparticles; quality by design; Plackett-Burman; central composite design-response surface methodology;release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4678 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.011

2022-01-24

湖南省自然科学基金资助项目（2021JJ30495）；湖南省大学生创新创业训练计划项目（2603）；湖南中医药大学中药学一流学科建设项目（4901-0200002006）

李姿锐（1998—），女，硕士生，研究方向为中药药剂学。E-mail: 309689146@qq.com

通信作者：李 雅（1973—），女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中药新药研究与开发。E-mail: liya112@163.com

[责任编辑 郑礼胜]