双参芎连颗粒对动脉粥样硬化大鼠细胞凋亡的影响

李然，谢朋呈，辛高杰，李磊，任建勋，刘建勋，付建华，2

1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100091；2.国家中医心血管疾病临床医学研究中心，北京 100091

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉硬化的主要类型，常引起严重的心脏损害。现代医学认为，AS病理基础为血液高凝状态、高纤维蛋白原血症、高红细胞压积等血液流变异常，临床常表现为胸痛、胸闷等胸部不适与头晕、头痛、言语活动障碍等先后或同时存在。有学者认为，高脂血症也是心血管疾病的危险因素。课题组前期针对AS疾病本虚标实的病机特点，通过不同配伍研究，并按照现代中药制剂要求对方药制剂工艺和质量标准进行优化，最终拟定具有益气活血、化痰解毒功效的双参芎连颗粒。本实验进一步观察双参芎连颗粒对AS模型大鼠细胞凋亡的影响，探讨其改善AS作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠182只，体质量（230±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF 级屏障环境，温度25 ℃，湿度60%，12 h光照/黑暗循环，自由摄食饮水。

1.2 药物

双参芎连颗粒（丹参、人参、川芎、黄连、泽泻、山楂、神曲），药材提取物由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所制备，批号20111012，1 g提取物相当于原药材2.44 g，用蒸馏水配制成浓度分别为0.08、0.16、0.32 g/mL。丹蒌片，吉林康奈尔药业，0.3 g/片，批号20110702，用蒸馏水配制成浓度为0.08 g/mL。辛伐他汀片（舒降之），杭州默沙东制药有限公司，批号110594，20 mg/片，用蒸馏水配制成浓度为0.4 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器

总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，安徽中生北控生物科技股份有限公司，批号均为20000271；高敏C反应蛋白（hs-CRP）ELISA试剂盒，美国BD公司，批号36559；氧化型低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL-C）ELISA 试剂盒，美国MY BioSource公司，批号201120409。2.0F球囊导管，美国Fogarty 公司；MIKRO-22R 高速台式冷冻离心机，德国Hettich公司；VX-380超低温冰箱，法国JOUAN公司；Milli-Q 纯水机，美国Merck Millipore 公司；RA-1000 全自动生化分析仪，德国Technicon 公司；SYNERGY-4酶标仪，美国Biotek公司；BX-41/BH-2光学显微镜，日本OLYMPUS。

1.4 造模

182只大鼠适应性饲养7 d后随机挑选26只作为空白组，予普通饲料喂养，其余大鼠予高脂饲料喂养，连续4周。第4周随机从空白组和造模大鼠中各抽取10只心脏取血，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离血清，测定TC、LDL-C含量。确定造模大鼠TC、LDL-C含量明显升高后，水合氯醛腹腔注射麻醉剩余造模大鼠，沿颈前正中线无菌切开皮肤，暴露颈前区左侧颈总动脉，结扎远心端，微动脉夹阻断近心端，眼科剪剪一“V”字形切口，插入2.0F球囊导管（预先用1∶15稀释的肝素钠生理盐水浸润），插入深度15 cm，向球囊内打入0.2～0.25 mL气体，使其充分扩张至有阻力感，匀速回拉球囊8～10 cm，重复上述操作5次，操作完成后回抽球囊内气体，取出球囊导管，结扎左侧颈总动脉近心端，无菌缝合切口，局部给予青霉素生理盐水消毒。

1.5 分组及给药

将手术大鼠随机分为模型组、丹蒌片组（0.8 g/kg）、舒降之组（4 mg/kg）和双参芎连颗粒低、中、高剂量组（原药材2、4、8 g/kg），于手术后3 d灌胃给药，给药体积1 mL/100 g，每日1次，连续8周，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水。给药期间除空白组外，其余各组大鼠继续高脂饲料喂养。

1.6 取材

给药结束后大鼠禁食12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，75%医用酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清；取腹主动脉组织，置于10%中性福尔马林固定，用于HE染色及免疫组化分析。

1.7 指标检测

1.7.1 血清相关指标检测

取5 mL 腹主动脉血，1 500 r/min 离心5 min，CHOD-PAP法检测血清TC、TG含量，聚乙烯硫酸一步测沉淀法检测LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量；ELISA检测血清ox-LDL-C、hs-CRP含量。

1.7.2 HE染色

取固定的腹主动脉组织，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察腹主动脉病理变化。

1.7.3 免疫组化染色

腹主动脉组织石蜡切片于75 ℃烘箱中烤片85 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分别浸泡30 min脱蜡；100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ各浸泡10 min，95%酒精、85%酒精、80%酒精浸泡5 min水化；蒸馏水洗3次，每次2 min，PBS洗3次，每次5 min，置于枸橼酸钠溶液中高压锅煮沸，高压120 s进行抗原修复；滴加Bcl-2、Bax一抗（1∶100），4 ℃冰箱过夜；次日室温恢复30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，室温孵育45 min；PBS清洗，DAB显色，蒸馏水冲洗2次；80%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ浸泡10 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min脱水透明，中性树脂封片；于显微镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达，计算阳性表达的平均光密度。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 双参芎连颗粒对模型大鼠血清相关指标的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平显著升高（＜0.01）；与模型组比较，丹蒌片组、舒降之组和双参芎连颗粒中、高剂量组大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平显著降低（＜0.05，＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清相关指标比较（）

2.2 双参芎连颗粒对模型大鼠腹主动脉病理变化的影响

空白组大鼠腹主动脉管腔结构正常，内皮完整，平滑肌细胞排列整齐，未见炎性细胞浸润及脂质沉积；模型组大鼠腹主动脉病灶表面纤维帽下可见大小不等的脂质空泡，并有淋巴细胞及中性粒细胞等炎性细胞浸润，中膜平滑肌细胞核固缩且排列紊乱，偶见内弹性膜断裂，并且随着造模时间延长，AS斑块面积略有增加；各给药组大鼠腹主动脉斑块内炎性细胞浸润减少，斑块面积缩小，以丹蒌片组、舒降之组、双参芎连颗粒高剂量组变化最为明显。见图1。

图1 各组大鼠腹主动脉组织形态（HE染色，×100）

2.3 双参芎连颗粒对模型大鼠腹主动脉组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠腹主动脉组织Bcl-2、Bax蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠腹主动脉组织Bcl-2 蛋白表达显著升高（＜0.01），Bax 蛋白表达显著降低（＜0.01）。见图2、图3、表2。

图2 各组大鼠腹主动脉组织Bcl-2阳性表达（免疫组化染色，×200）

图3 各组大鼠腹主动脉组织Bax阳性表达（免疫组化染色，×200）

进一步比较Bcl-2/Bax比值变化，结果显示，与空白组比较，模型组Bcl-2/Bax比值显著降低（＜0.01）；与模型组比较，各给药组Bcl-2/Bax 比值显著升高（＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠腹主动脉组织Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值比较（）

3 讨论

AS是由脂质驱动的中型动脉和主动脉慢性炎症性疾病，首先是低密度脂蛋白和残余脂蛋白颗粒积聚，其特征是动脉壁有纤维脂肪沉积。研究表明，AS与血管平滑肌细胞凋亡密切相关，在AS早期，血管平滑肌细胞容易发生凋亡。大部分间质胶原纤维由血管平滑肌细胞生成，有助于增加纤维帽的抗拉强度，因此，平滑肌细胞凋亡可干扰AS斑块的稳定性。平滑肌细胞凋亡也会加重炎症反应，进一步增加斑块的不稳定性。血管壁细胞凋亡的靶向干预可为AS及其主要并发症的治疗提供方向。高脂血症是以血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低为主要表现的全身脂代谢异常疾病，是导致AS，进而发展成为心脑血管疾病的主要危险因素之一。本研究采用高脂饮食及腹主动脉损伤结合的方法建立AS大鼠模型。高脂饮食喂养导致脂质代谢紊乱，主要表现为大鼠血清TC、LDL-C水平升高，各给药组大鼠血清TC、LDL-C水平不同程度降低，表明双参芎连颗粒具有降血脂作用。由于大鼠可能对AS的形成具有一定抵抗力，因此本实验采用腹主动脉球囊损伤破坏血管内膜，加速血管中脂质沉积，促进炎症和AS斑块形成。LDL-C是血液中的主要脂蛋白成分，氧化后可转化为ox-LDL-C，并通过与巨噬细胞清道夫受体结合诱导脂质吞噬，从而形成泡沫细胞并导致AS。hs-CRP是一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，被认为是由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素。本实验中，模型组大鼠血清ox-LDL-C、hs-CRP水平显著升高，结合腹主动脉病理观察，表明有斑块形成并伴有血管壁炎性细胞浸润，给药组大鼠血清ox-LDL、hs-CRP水平显著降低，说明药物干预可缩小斑块，减轻炎症反应，与病理观察结果一致。

细胞凋亡是AS病理过程的重要部分，AS斑块除内膜增厚和炎性细胞浸润外，还存在大量细胞凋亡和基质裂解现象。Bcl-2和Bax与细胞凋亡关系最为密切，Bcl-2通过与结合体Apof-1作用抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，而Bax作用与其相反。此外，Bcl-2通过其BH3结构域与促凋亡Bax、Bak基因形成异二聚体，从而维持促凋亡成员在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序。Bcl-2和Bax之间存在动态平衡，Bcl-2/Bax 比值升高时，细胞凋亡受到抑制，Bcl-2/Bax比值降低则促进细胞凋亡。本实验中，模型组大鼠腹主动脉损伤部位血管组织Bcl-2、Bax蛋白表达升高（＜0.01），Bcl-2/Bax比值降低（＜0.01），表明炎症诱导的细胞凋亡在AS发展中被激活，各给药组大鼠腹主动脉组织Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调，Bcl-2/Bax比值升高，表明药物干预可不同程度抑制AS形成[11-12]。

AS属中医学“胸痹”“脉痹”等范畴。其病机为本虚标实，本虚主要表现为气虚、阴虚、阳虚，标实主要表现为毒邪、痰浊、血瘀致心脉阻塞。针对AS“痰浊毒瘀”的病机演变，课题组拟祛痰化瘀组方双参芎连颗粒，方中丹参、川芎、人参共行祛瘀通脉之功，泽泻、山楂、神曲、黄连兼施化痰解毒之效。全方具有益气活血、化痰解毒功效。

综上所述，双参芎连颗粒能调节AS大鼠脂质代谢，抑制血管组织细胞过度凋亡，延缓AS发展，稳定斑块。其作用机制可能与降低大鼠血清TC、LDL-C、ox-LDL-C、hs-CRP水平，改善腹主动脉病理损伤，下调促凋亡蛋白Bax表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关。本研究结果可为双参芎连颗粒进一步应用于AS相关疾病的治疗提供实验依据。