苍术-玄参药对HPLC指纹图谱的建立及指标性成分研究*

刘利利，刘颖新，彭攸灵，毛群芳，邱艳明，彭丽英

(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

苍术-玄参药对配伍出自《施今墨对药》，二者相须为用，临床常用于糖尿病的治疗[1]。在前期工作中，课题组对该药对的进行了配伍比例、提取工艺以及有效部位等方面相关研究[2-4]，但目前对于该药对的物质基础研究相对不足。指纹图谱技术可以反映复杂中药体系中化学成分的种类与数量，具有客观、全面的优点[5-6]。本研究从 HPLC指纹图谱及多指标成分定量分析的角度，探讨了苍术-玄参药对配伍的物质基础，为苍术、玄参配伍规律揭示，以及制剂开发等提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷伦科技有限公司；AE240型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试 药

乙腈为色谱纯，美国TEDIA公司；水为怡宝纯净水；其他试剂均为分析纯。对照品毛蕊花糖苷(批号：PS000442)、安格洛苷C(批号：PS000098)、哈巴俄苷(批号：PS000404)、肉桂酸(批号：PS000800)、白术内酯Ⅰ(批号：PS010510)、白术内酯Ⅱ(批号：PS010511)、β-桉叶醇(批号：PS010584)、苍术素(批号：PS010182)，以上对照品纯度均>98%，均购自成都普思生物科技股份有限公司。不同产地及批号苍术、玄参样品均经湖南中医药高等专科学校彭学著教授鉴定为：菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.) DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎；玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，药材及配伍信息见表1。

表1 药材及配伍信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液

精密称取毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素的对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为4.780、5.216、4.305、5.681、5.510、4.742、3.751和4.523 mg·mL-1的单一对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液各1 mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为毛蕊花糖苷478.0 μg·mL-1、安格洛苷C 521.6 μg·mL-1、哈巴俄苷430.5 μg·mL-1、肉桂酸568.1 μg·mL-1、白术内酯Ⅰ 551.0 μg·mL-1、白术内酯Ⅱ 474.2 μg·mL-1、β-桉叶醇375.1 μg·mL-1、苍术素452.3 μg·mL-1的混合对照品溶液Ⅰ，精密吸取适量，依次用甲醇稀释 2、5、10、25、50倍，分别作为溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

2.2 供试品溶液

精密称取苍术粉末(过60目筛)2.0 g，置于具塞锥形瓶，加无水乙醇20 mL，超声提取1.5 h，乙醇补足损失，5000 r·min-1离心15min，取上清液，过微孔滤膜，即得苍术供试品溶液。精密称取玄参粉末(过60目筛)1.0 g，置于具塞锥形瓶，加无水乙醇10 mL，超声提取1.5 h，乙醇补足损失，5000 r·min-1离心15 min，取上清液，过微孔滤膜，即得玄参供试品溶液。取苍术药粉2.0 g和玄参药粉1.0 g(二者均过60目筛)，置于具塞锥形瓶中，加无水乙醇20 mL，超声提取1.5 h，乙醇补足损失，5000 r·min-1离心15 min，取上清液，过微孔滤膜，即得苍术-玄参药对供试品溶液。

2.3 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%→10%A；10～12 min，10%→20%A；12～28 min，20%→50%A；28～45 min，50%→63%A；45～55 min，63%→65%A；55～65 min，65%→80%A；65～75 min，80%→5%A)。在205 nm波长下检测白术内酯Ⅱ和β-桉叶醇；280 nm波长下检测毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ和苍术素。流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样量15 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(C1-X1)，按“2.3”项下色谱条件连续进样 6 次，以白术内酯Ⅰ色谱峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均<2.0%，相对峰面积的RSD均<2.6%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(C1-X1)，按“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h，进样测定，以白术内酯Ⅰ色谱峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均<1.2%，相对峰面积的RSD均<2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验

取同一药对苍术、玄参药材，按“2.2”项下方法平行制备 6份药对供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以白术内酯Ⅰ色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均<1.5%，各共有峰相对峰面积的RSD均<1.8%，表明方法重复性良好。

2.5 苍术-玄参药对配伍前后指纹图谱研究

2.5.1 指纹图谱建立及相似度评价

取药对供试品溶液按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。将所得的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012 版)》，得苍术-玄参药对HPLC指纹图谱，见图1。以16号峰白术内酯Ⅰ色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD<2.00%，表明色谱峰出峰稳定。不同样品各共有峰的相对峰面积相差较大，表明不同配伍药对的成分含量存在差异，结果见表2。对10批样品进行相似度评价，结果表明样品相似度均>0.90，说明各批次样品相似度良好，方法稳定，结果见表3。

图1 10批苍术-玄参药对HPLC叠加图谱

表2 苍术-玄参药对样品共有峰的相对峰面积

续表2

表3 药对指纹图谱相似度评价结果

2.5.2 色谱峰的归属

由图2可以看出，1～5号峰来源于玄参，6～18号峰来源于苍术，通过混合对照品色谱图对样品指纹图谱各峰进行定性分析，结果表明编号 1、3、4、5、10、16、17、18号峰分别为毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、β-桉叶醇和苍术素。

图2 混合对照品(A)、苍术C1(B)、玄参X1(C)及苍术-玄参药对C1-X1(D)的HPLC图谱

2.5.3 聚类分析

将10批苍术-玄参药对指纹图谱的18个共有峰的相对峰面积数据导入SPSS 22.0软件，采用Ward法聚类，以平方Euclidean距离为量度，进行聚类分析，结果见图3。当类间距为5时，样品可聚为 3类，S2、S6、S10号样品为一类，S1、S3 ～ S5、S8～S9号样品为一类，S7号样品单独聚为一类。

图3 10批苍术-玄参药对聚类分析图

3 苍术、玄参配伍前后指标性成分含量变化研究

3.1 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ适量，在“2.3”项色谱条件下进样测定，以对照品的质量为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，进行回归，结果见表3。由结果可知，各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系

3.2 精密度试验

取“2.1”项下混合对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素峰面积RSD分别为1.13%、0.96%、1.07%、0.94%、0.98%、1.25%、1.22%、1.06%，表明仪器精密度良好。

3.3 重复性试验

将药对C1-X1样品，按“2.2”项的制备方法平行制备 6 份，在“2.3”项的色谱条件连续进样，记录毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素峰面积，计算药对C1-X1样品8种待测成分重复性的RSD，分别为 0.95%，0.83%，0.72%，1.09%、1.23%、1.12% 、1.08%和0.86%，表明本试验方法的重复性良好。

3.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液(C1-X1)，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素峰面积RSD分别为0.88%、1.28%、0.89%、0.92%、1.30%、1.26%、0.90%、1.17%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

3.5 加样回收率试验

取“3.4”项下已测知8种成分准确含量的C1-X1供试品9 份，再分别精密加入相当于含量120%、100%、80%的毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素对照品溶液，分别制备得到高、中、低不同浓度的供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算平均加样回收率分别为98.28%、99.21%、101.30%、95.72%、96.59%、100.16、97.02%和99.78，RSD分别为0.81%、0.97%、1.16%、1.28%、1.21%、0.92%、0.90%和1.32%。

3.6 样品含量测定

按“2.2”项下方法制备苍术(C1～C10)、玄参(X1-X10)以及药对(C1～X1)～(C10～X10)供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定各样品中毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇和苍术素等 8种成分的含量。结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(n=3)

4 讨 论

4.1 色谱条件的选择

实验过程中考察了不同的流动相的组成，结果发现，乙腈-磷酸水对峰形改善有较大的帮助作用，而且避免了个别色谱峰的拖尾问题，且磷酸的浓度对峰形影响不大。流动相的流速对出峰时间和分离效果影响较大，当流速大于0.8 mL/min时，部分色谱峰分离度较低。此外，柱温低于30 ℃时，部分色谱峰峰形不对称。

4.2 结果分析

通过 HPLC 法建立了苍术-玄参药对的指纹图谱，10 批样品的相似度均>0.90，符合指纹图谱研究要求，为该药对质量控制整体提升提供了依据。由苍术、玄参单味药材及药对化学成分含量分析可知，该药对配伍后毛蕊花糖苷、安格洛苷C、白术内酯Ⅱ、β-桉叶醇、苍术素含量有一定程度增高，而哈巴俄苷、肉桂酸、白术内酯Ⅰ含量有所降低。这些指标性成分的含量变化为该药对进一步的药理机制研究和临床应用提供了参考。

5 结 论

通过本研究建立的苍术-玄参药对指纹图谱及含量测定方法稳定可靠，能快速、准确地对药对进行质量评价，同时为含有该药对的制剂质量控制提供了参考。