调控氧化猪脂的香气成分分析

甄大卫， 徐玉霞， 张晨萍，2， 张 玲， 谢建春,*， 孙宝国

(1.北京工商大学 轻工科学技术学院， 北京 100048； 2.忻州师范学院， 山西 忻州 034000)

脂肪受热氧化可产生人们喜爱的风味[1]，脂肪氧化对不同种动物肉特征风味的形成有贡献[2-3]。脂肪调控氧化，指在控制通空气量及加热温度的条件下将脂肪氧化到某个程度。调控氧化脂肪与蛋白酶解物、氨基酸、还原糖进行热反应，即“脂肪调控氧化- 热反应”两步法，制备的肉味香精具有肉香浓郁、动物肉的特征香味突出的优点[4-5]。脂肪氧化遵循自由基反应历程，氧化过程极其复杂，氧化时可产生烃类、醛类、酮类、酸类、酯类、呋喃类等挥发性化合物[1]。脂肪氧化产生的羰基化合物易于参与美拉德反应，形成带烷基链的杂环化合物，如在“半胱氨酸- 还原糖”美拉德反应体系中，(E,E)-2,4-癸二烯醛可分别与氨、硫化氢反应，生成2-戊基吡嗪、2-戊基噻吩[5-6]。脂肪醛还可与美拉德反应中产生的二氢吡嗪反应，生成带烷基链的吡嗪[7]。

由于挥发性风味物质(香气物质)的强亲脂性，脂肪中的挥发性风味物质较难分离。研究者们曾采用吹扫- 冷阱捕集[8-11]、超临界CO2萃取[12-13]、同时蒸馏萃取[14]、顶空固相微萃取[14-15]等方法结合气- 质联机(gas chromatography and mass spectrometry，GC- MS)分析脂肪氧化产生的香气物质。吹扫- 冷阱捕集法收集挥发性组分损失大，超临界CO2萃取法需专用设备，同时蒸馏萃取法热敏感性成分可能被破坏。顶空固相微萃取法，操作简单，但萃取量小，对痕量组分检测灵敏度不理想[15]。在食品风味分析中，GC- MS给出的为挥发性化合物信息，要获知哪些成分对总体香气有贡献，还须采用气相色谱- 嗅闻法(gas chromatography-olfactometry，GC- O)对样品中的香气活性成分进行分析[16-17]。GC- O分析时常采用芳香提取物稀释分析(aroma extract dilution analysis，AEDA)法检测，化合物的稀释因子(flavor dilution, FD)越大，表示该化合物对总体香气的贡献越大。

有关脂肪调控氧化工艺研究人们已进行了较多报道，脂肪调控氧化产物往往采用过氧化值、酸值指标进行表征[4-5]，但脂肪调控氧化到不同程度(即氧化指标不同时)所具有的香气物质构成及差异尚不清楚。本研究随氧化时间延长获得3个具有不同氧化程度且感官气味具有代表性的调控氧化猪脂样品，然后利用溶剂辅助蒸发(solvent assistant flavor evaporation，SAFE) 装置具有的高真空蒸馏并液氮冷凝优势，直接蒸馏收集挥发性组分，再采用GC- MS和AEDA/GC- O法分析香气物质构成。我国是猪肉生产及消费大国，猪肉风味深受大众喜爱。研究结果对于进一步了解脂肪调控氧化机制及完善“脂肪调控氧化- 热反应”两步法制备猪肉味香精的工艺具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

精炼猪脂，安徽牧羊油脂有限公司。

冰醋酸(分析纯)、乙醇(质量分数为95%)、乙醚(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、碘化钾(分析纯)、硫代硫酸钠(分析纯)、可溶性淀粉(化学纯)、酚酞(化学纯)、氢氧化钾(化学纯)，国药集团化学试剂公司；邻二氯苯(分析纯)，北京化学试剂公司；二氯甲烷(色谱纯)、C5～C30正构烷烃(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，迪马科技有限公司；乙醛(质量分数为95%，以下标准品括号内均为质量分数)、丙醛(95%)、丁醛(95%)、丁醇(95%)、1-戊烯-3-醇(95%)、戊醛(98%)、戊醇(95%)、己醛(95%)、(E)-2-己烯醛(95%)、2-庚酮(95%)、庚醛(95%)、2-庚醇(95%)、(E)-2-庚烯醛(95%)、1-辛烯-3-醇(95%)、2-辛酮(95%)、2-戊基呋喃(95%)、辛醛(98%)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(95%)、(E)-3-辛烯-2-酮(95%)、(E)-2-辛烯醛(95%)、辛醇(95%)、2-壬酮(95%)、壬醛(95%)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(95%)、(E)-2-壬烯醛(98%)、壬醇(95%)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(95%)、(E)-2-癸烯醛(95%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(95%)、(E)-2-十一烯醛(95%)、(E)-2-十二烯醛(95%)、2-十三酮(95%)、(E)-3-壬烯-2-酮(95%)，百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

溶剂辅助蒸发装置，莘县玻璃仪器有限公司定制；XDS5型复合分子涡轮泵，英国Edwards公司；DF2101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司；D- 8403型电动搅拌器，天津市华兴科学仪器厂；7890A- 5975C型气相色谱- 质谱联用仪(配有电子轰击离子源)、7890A型气相色谱(配有FID检测器)，美国Agilent公司；DATU2000型嗅闻仪，美国DATU Inc公司。

1.3 实验方法

1.3.1猪脂的氧化

在装有电动搅拌器、温度计和回流冷凝管的2 000 mL五口烧瓶中加入500 g精炼猪脂，加热使其熔化，当温度上升到130 ℃，开始通空气搅拌，并计时，空气流速1.2 L/min，转速为450～500 r/min，在氧化时间为1、3、4 h取样，参照文献[4]测过氧化值和酸值。

1.3.2挥发性组分分离

溶剂辅助蒸发装置见图1。超级恒温水浴为50 ℃，液氮冷凝，系统压力为5×10-4Pa。将1.3.1节所得氧化猪脂全部蒸馏处理，蒸馏完毕，将收集液冷冻离心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上层油状液体加无水硫酸钠干燥，将液体小心倾倒出并用0.45 μm膜过滤。量取液体样品体积，然后待GC- MS及GC- O分析。

1.滴液漏斗；2.超级恒温水槽；3.蒸馏瓶；4.蒸馏头；5.冷阱；6.收集烧瓶；7.保温瓶。

1.3.3气相色谱-质谱分析

1.3.2节所得样品加入内标邻二氯苯， 内标在样品中的质量浓度为60 μg/mL(溶于二氯甲烷后添加)，GC- MS分析的色谱柱为DB- WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升温程序：起始40 ℃，以2.5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，230 ℃运行2 min。载气为He，流速1 mL/min。进样品温度为250 ℃，分流比为30∶1，进样量为0.2 μL。

电子轰击离子源，电子能量70 eV；辅助加热线温度230 ℃；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，全扫描模式，质量扫描范围m/z40～450。

1.3.4气相色谱-嗅闻分析

色谱柱为HP- 5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：起始温度40 ℃，以5 ℃/min升到280 ℃，保持3 min；进样口温度250 ℃，载气N2，流速1 mL/min，进样0.2 μL。

3名评价员(2男、1女)，平均年龄23岁，事先采用香料标准品进行培训。对1.3.2节所得样品用溶剂二氯甲烷按照2的倍数逐级稀释，并进行GC- O分析，直到嗅闻不到气味时停止，每种化合物的最高稀释倍数记为其稀释因子(flavor dilution, FD)。

1.4 数据处理

气- 质联机分析采用检索NIST 2010质谱库、保留指数及标品鉴定化合物，化合物含量按照式(1)计算，取两个平行样品的均值。嗅闻分析基于GC- MS分析结果、保留指数、嗅闻的气味及标准品鉴定化合物，将3名评价员均嗅闻到的化合物作为结果，稀释因子为3名评价员的均值。

(1)

式(1)中，Wi为化合物的质量比，ng/g脂肪；Ai为化合物的峰面积；As为内标的峰面积；Cs为内标的质量浓度，μg/mL；V为所得蒸馏液体积，mL；m为氧化脂肪的质量，g。

2 结果与分析

2.1 3个不同氧化程度猪脂样品信息

随反应时间延长，获得的3个具有不同氧化程度且感官气味有代表性样品的信息，见表1。

表1 3个不同氧化程度猪脂样品的氧化指标和气味特征

在脂肪调控氧化过程中，随氧化时间的延长及氧化程度的升高，氧化脂肪的主要气味变化为“带青草香- 浓油脂香- 有刺激气味”。在氧化时间1、3、4 h取出表示上述气味特征变化的3个代表性样品，标为1号、2号、3号，样品的氧化程度用过氧化值、酸值表示。由表1可知，1号样品稍带青草香，而随着氧化时间延长，氧化程度的升高，2号样品则为浓油脂香，3号样品则有刺激性气味。

2.2 3个不同氧化程度猪脂样品挥发性成分GC- MS分析结果

3个氧化猪脂样品的挥发性成分GC- MS分析结果，见表2。3个样品中共鉴定出91个化合物，包括醛类20个，酮类9个，醇类12个，酸类17个，呋喃类4个，酯类11个，烷烃类18个。3个样品均是醛类个数最多且含量最高，分别为19、19、20个，质量分数占46.23%、54.24%、67.11%；其次是酸类，分别占24.32%、13.10%、12.61%。3个样品中含量高的前5个化合物均是己醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇和己酸。史亚静等[18]采用吹扫捕集- GC- MS研究猪油风味物质,检测到较高含量的己醛、(E)-2-辛烯醛。徐永霞等[19]采用SPME- GC- MS在氧化猪脂肪中检测较高含量的(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇和己酸。比较3个样品，1号样品中鉴定出84个挥发性化合物；2号样品中鉴定出挥发性化合物个数最多，为87个；3号样品中鉴定出挥发性化合物个数最少，为76个。比较单个挥发性化合物的质量比以及所有挥发性化合物的质量比和，也是随氧化程度升高，为先升高后降低，总体上2号样品中挥发性化合物的质量比最高。3号样品的氧化程度高于2号样品，其鉴定出的挥发性化合物总量反而减少，这可能与氧化时间长及氧化程度高时，体系内有些挥发性化合物发生复杂的二次反应(如醛类化合物之间发生羟醛缩合反应)甚至聚合反应变成不挥发性化合物有关[20]。脂肪在空气中受热氧化为复杂的自由基反应，通常条件下，脂肪中的不饱和脂肪酸易于氧化[20]。前期研究表明：动物脂肪的调控氧化为温和氧化，主要为其所含油酸、亚油酸氧化成氢过氧化物[21]，氢过氧化物降解则产生挥发性化合物。检测到的辛醛、壬醛、2-癸烯醛，可由油酸氧化降解产生；检测到的戊醛、己醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、戊醇，可由亚油酸氧化降解产生；检测到的丙醛、丁醛、(E)-2-丁烯醛、(E)-2-戊烯醛、(E)-2-己烯醛，可由亚麻酸氧化降解产生[20]。脂肪氧化产生的醛进一步氧化可产生酸，酸与醇反应可产生酯[22]。

表2 3个不同氧化程度猪脂样品的SAFE- GC- MS分析结果

续表2

续表2

早期动物油常作为食品煎炸油使用，因而相关文献较多地报道了猪脂高温加热下(如190 ℃)产生的挥发性成分[9-11]。经比较，本研究检测的化合物在这些文献中几乎均有报道。但本实验鉴定出的醛类化合物数量远多于Song等[3]、Ramirez等[23]采用顶空固相微萃取/气- 质联机分析脂肪氧化产物或煎脂肪的结果。这除了与样品不同有关外，很可能还与本研究先采用SAFE装置高真空蒸馏得到挥发性样品，然后进行分析，从而提高了GC- MS检测灵敏度有关。

2.3 3个不同氧化程度猪脂样品香气成分GC- O分析结果

3个氧化猪脂样品香气成分的AEDA/GC- O分析结果, 见表3。Young等[24]曾采用吹扫捕集/GC- O分析100 ℃加热牛脂肪的香气成分，鉴定出16个化合物。但总体而言，文献报道的关于加热脂肪风味的分析，多数仅采用气- 质联机分析了挥发性成分，而并未采用GC- O分析“香气活性”成分。本实验GC- O分析中，检测到的气味类型包括青香、油脂香、蘑菇香、甜香、奶香、水果香等，其中以“青香”“脂肪香(油脂香)”出现的频率高。GC- O分析共鉴定出39个化合物，包括22个醛、7个酮、6个醇、2个酯，以及2-戊基呋喃和(E)-6-十二烯，即鉴定出的多数化合物为脂肪醛，表明脂肪醛为脂肪调控氧化产生的主要风味物质。值得注意的是，GC- MS检测到的烃类、酸类化合物(见表2)，GC- O均未检测到，这与烃类、酸类化合物往往具有较高气味阈值有关。GC- MS检测到的酯类化合物，仅有2种GC- O检测有气味活性，这除了与气味阈值有关外，还与多数酯的含量较低有关。

表3 3个不同氧化程度猪脂样品的SAFE- GC- O分析结果

续表3

将表3结果绘制成图2，对3个样品的GC- O结果进行比较。由图2可知，与GC- MS分析结果一致，2号样品GC- O检测出的香气活性化合物数量最多。3号样品中检测到的香气活性化合物不仅数量少，且稀释因子均较低，这可能是造成3号样品的油脂香气较2号样品弱的原因，而与2号样品相比，3号样品中短链醛(如戊醛)的数量占比例大。短链醛一般有尖刺气味，这可能是造成3号样品有刺激性气味的原因。与2号样品不同，1号样品有青草香气，可能因1号样品含有的油脂香气化合物的数量稍少于2号(例如，1号样品未检测到辛醇、壬醛)或稀释因子低于2号样品中[如1号样品中的(E,E)-2,4-癸二烯醛稀释因子低于2号样品]造成。

化合物编号对应表3中化合物名称。

由图2和表3可知，2号样品中稀释因子高(log2FD≥11)的为1-辛烯-3-醇(编号26)、己醛(编号6)、(E)-2-辛烯醛(编号11)、(E)-2-壬烯醛(编号13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(编号20)、(E)-2-十二烯醛(编号22)、戊醛(编号4)、庚醛(编号7)、2-戊基呋喃(编号39)；1号样品中稀释因子高(Log2FD≥10)的为(E)-2-十二烯醛(编号22)、1-辛烯-3-醇(编号26)、己醛(编号6)、戊醛(编号4)、(E)-2-辛烯醛(编号11)、(E)-2-壬烯醛(编号13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(编号20)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(编号17)、(E)-2-庚烯醛(编号8)、2-壬酮(编号33)；3号样品中稀释因子高(log2FD≥4)的为己醛(编号6)、(E)-2-庚烯醛(编号8)、(E)-2-辛烯醛(编号11)、1-辛烯-3-醇(编号26)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(编号20)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(编号17)、(E)-2-壬烯醛(编号13)、戊醛(编号4)、庚醛(编号7)、2-壬酮(编号33)。稀释嗅闻法中，化合物的稀释因子越大，表明其对总体香气贡献越大。因而上述这些稀释因子大的化合物对各自样品的总体香气有重要贡献。其中上述的3个代表性样品共有的重要化合物为：1-辛烯-3-醇(编号26)、己醛(编号6)、(E)-2-辛烯醛(编号11)、(E)-2-壬烯醛(编号13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(编号20)、戊醛(编号4)，故认为它们是不同氧化程度调控氧化猪脂样品中均存在的重要香气成分。而这几个化合物在对猪肉的风味分析中常检测到。例如，Wang等[25]利用SAFE- AEDA/GC- O分析不同加工方式的4种猪肉汤检测到了己醛。Timon等[26]采用吹扫捕集及频率法GC- O分析炸猪里脊肉，鉴定出戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇，且这3种化合物的检测频率都很高。Zhao等[27]分析炖煮黑猪肉汤，检测出戊醛、己醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇，其中(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛有较高的稀释因子；肖群飞等[22]在猪五花肉炖煮肉汤中鉴定出33个香气化合物，己醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇也具有较高稀释因子。徐永霞等[28]报道清炖肉汤中己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇是关键香味化合物。Xie等[29]在小香猪烤肉中鉴定出戊醛、己醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中戊醛、己醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛的检测频率高，对小香猪烤肉的香气有重要贡献。

3 结 论

随反应时间取样获得3个不同氧化程度且感官气味有代表性的氧化猪脂样品，采用GC- MS分析共鉴定出91个挥发性化合物，以醛类数量最大及含量最高。随着氧化程度升高，样品气味特征从有青草味、到典型油脂味、再到有刺激性气味变化，样品的挥发性化合物数量和含量呈现先增大后减少的趋势，其中的氧化程度适中的样品鉴定出的化合物数量最多且含量最高。采用GC- O分析共鉴定出39个香气化合物，仍以醛类化合物数量最多，且仍是氧化程度适中样品中鉴定出的香气化合物数量最多。氧化程度过高的样品(过氧化值271.5 mmol/kg、酸值3.10 mg KOH/kg)鉴定出的香气化合物数量反而少，可能与氧化时间长时，氧化反应复杂化有关。综合3个样品的GC- O分析结果，得出猪脂调控氧化不同程度均具有的重要香气成分为1-辛烯-3-醇、己醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、戊醛。