巯基化党参多糖对鼠李糖乳杆菌肠道黏附定植作用的影响

曹恺欣， 武俊瑞,3， 李 默， 韩 琦， 于 博， 祁姝旖，王子健， 乌日娜,3,*

(1.沈阳农业大学 食品学院， 辽宁 沈阳 110866；2.辽宁省食品发酵技术工程研究中心， 辽宁 沈阳 110866；3.沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室， 辽宁 沈阳 110866)

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，当其黏附于宿主肠道内时，才能发挥调节肠道微生态失调、促进机体免疫功能提升等作用[1-2]。由于外源性益生菌的肠黏膜黏附性差、竞争力弱和定植困难等原因[3-4]，外源性益生菌的补充在影响人类肠道菌群构成、促进健康方面的作用是有限的。因此，提高益生菌的肠道黏附能力成为益生菌在宿主肠道中稳定定植的关键[5]。

巯基化合物具有良好的生物黏附性，能与益生菌表面蛋白上的半胱氨酸残基形成二硫键[6]，也可通过巯基或二硫键的交换反应，与黏液凝胶层中富含半胱氨酸的区域形成二硫键，通过共价键紧密结合于黏膜[6-8]，进而连接益生菌和肠黏液，促进益生菌的肠道定植。Leitner等[8]通过证实巯基化聚合物能与黏蛋白间形成二硫键，为巯基化聚合物黏膜黏附机理提供了依据。徐咏梅等[9]研究发现，巯基化羧甲基壳聚糖能保留羧甲基壳聚糖的生物特性，同时也具备优良的生物黏附性。

多糖具有保护肠道屏障，免疫调节等益生作用[10]。党参多糖(Codonopsispilosulapolysaccharide)具有改善肠道微生态的功能，其表面含有大量的羟基，可经过化学修饰得到巯基化合物[11]。目前已有关于香菇柄多糖的乙酰化修饰[12]，青钱柳多糖的羧甲基化修饰的研究[13]，但尚未见将党参多糖化学修饰后应用于益生菌肠道定植方面的报道。鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)是人体肠道内重要的益生菌[14]，能耐受胃液进入肠道，维护肠道菌群平衡和肠道稳态平衡，且全基因组明确，易于对其进行肠道定植的定量分析[15]。本研究将前期分离纯化所得党参多糖组分(CPP-2)进行羧甲基化修饰，得到羧甲基党参多糖(C-CPP-2)，再对其进行巯基化修饰，得到巯基化党参多糖(sC-CPP-2)。利用与LGG的体外肠道黏附实验以及与海藻酸钠形成的复合膜，分析党参多糖及其修饰组分对LGG黏附性的影响，并验证sC-CPP-2与肠道黏液之间的相互作用关系，以期为促进益生菌的肠道黏附定植研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钠、一氯乙酸、冰醋酸、甲醇、盐酸、溴化钾、酚酞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、十二烷基硫酸钠(SDS)、MRS琼脂培养基，均购自北京索莱宝生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自美国Sigma-Aldrich公司；硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，购自北京化学试剂厂。以上试剂为分析纯。live/dead®BacLight TM细菌活性试剂盒Syto 9，美国Thermo Fisher Scientific公司。

LGG，由内蒙古伊利实业集团股份有限公司馈赠；Sprague-Dawley大鼠(8～10周龄BALB/c雄性小鼠)，北京华阜康生物科技有限公司提供，每笼饲养3只，光/暗循环12 h，自由取食饮水，驯化1周，实验前需禁食(不禁水)至少48 h。实验动物伦理编号：License No. SYXK2021-0001。

1.2 主要仪器与设备

MLS- 3780型高压蒸汽灭菌锅，日本三洋公司；Nicolet- 170型傅里叶红外光谱仪(FT-IR)，美国Nicolet公司；SHA- B型恒温水浴锅，金坛市精达仪器制造厂；ZEN1500型自动电位滴定仪，英国Malvern公司；FD53型高温干燥箱，德国Binder公司；AR- 1500型流变仪，北京欧亚星宇科技有限公司；Secura225D- 1CN 型天平，德国Sartorius公司。S8100型扫描电子显微镜，日本日立高科技公司；LSM 710型激光共聚焦显微镜，德国Lavision Biotec公司。

1.3 实验方法

1.3.1C-CPP-2的制备及结构表征

1.3.1.1 C-CPP-2的制备

取1 g CPP-2充分溶于50 mL去离子水中，加入150 mL NaOH溶液(3 mol/L)，搅拌10 min后加入20 g一氯乙酸，65 ℃下反应4 h，冷却至室温，调节pH值至7.0，进行透析，直至剩余试剂被消除。将透析得到的产物真空冷冻干燥，即得C-CPP-2。

1.3.1.2 羧甲基取代度的测定

参照Li等[16]和房斐等[17]的方法，利用中和滴定法测定C-CPP-2羧甲基取代度(DS)。取10 mg C-CPP-2于100 ℃干燥1 h，冷却至室温，加入3 mL体积分数为70%的甲醇水溶液，充分搅拌5 min，用50 mL NaOH溶液(0.5 mol/L)稀释，搅拌3～5 h。计算方法见式(1)和式(2)。

DS=0.162X/(1-0.058X)；

(1)

X=C1V1-C2(V2-V0)。

(2)

式(1)中，DS为羧甲基取代度；

式(2)中，C1为NaOH浓度，0.5 mol/L；V1为氢氧化钠溶液体积，50 mL；C2为盐酸浓度，0.1 mol/L；V2为消耗的盐酸溶液体积，mL；V0为空白溶液消耗的盐酸溶液体积，mL。

1.3.1.3 红外光谱分析

取20 mg CPP-2样品，与200 mg溴化钾研磨后压成球团，用红外光谱仪在400～4 000 cm-1内进行光谱扫描，确定羧基的取代情况。

1.3.2sC-CPP-2共轭物的制备及结构表征

1.3.2.1 sC-CPP-2共轭物的制备

取100 mg C-CPP-2充分溶解于20 mL蒸馏水中，加入166 mg EDC，室温搅拌1 h，在氮气保护下加入76 mg NAC，搅拌24 h，蒸馏水透析24 h，真空冷冻干燥，得到sC-CPP-2。

1.3.2.2 巯基含量的测定

参照段好刚[6]的方法，取50 mg sC-CPP-2，溶于100 mL去离子水中，取1 mL样品溶液采用Ellman’s法测定其吸光度，根据式(3)计算sC-CPP-2中巯基含量。

Y=(X+0.012 7)/3.495。

(3)

式(3)中：Y为巯基含量，μmol/g；X为421 nm处测定的吸光度值。

1.3.2.3 电位变化分析

根据Liu[7]的方法，利用电位质子滴定法测定CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2的ζ-电位。

1.3.3sC-CPP-2对LGG的黏附效果的测定

1.3.3.1 肠黏液的制备

参照北婷婷[18]的方法制备大鼠肠黏液，并于超低温保藏。

1.3.3.2 CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG悬液的制备

将LGG菌体重悬于PBS中，调整LGG菌浓度为109CFU/mL。取5 mg CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2分别加入1 mL菌液中，混合均匀，得CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG混合悬液，对照组为生理盐水/LGG(NS)。

1.3.3.3 sC-CPP-2体外黏液黏附实验

参照北婷婷[18]的方法，检测肠黏液对LGG的黏附作用。在96孔细胞培养板中加入1.3.3.1中制备所得肠黏液，并分别加入1.3.3.2中制备所得混合悬液，密封置于4 ℃冰箱过夜，吸取缓冲液洗涤2次。加入体积分数为1%的SDS与0.1 mol/L NaOH混合的裂解液，释放黏附的细菌。进行平板活菌计数，根据式(4)计算肠黏液对LGG的黏附率。

黏附率=B/A×100%。

(4)

式(4)中：A为总细菌数，CFU/mL；B为黏附的细菌数，CFU/mL。

1.3.3.4 sC-CPP-2的体外肠道黏附实验

脊椎脱臼法处死大鼠后，铺4份1.5 cm×1.5 cm×2 mm的大鼠肠道于无菌载玻片上，分别滴加1.3.3.2中制备所得混合悬液。将载玻片放置于灭菌离心管中轻微振荡2 h后用生理盐水冲洗，并将冲洗液收集后梯度稀释，活菌计数，根据式(5)计算黏附率。

黏附率=(A-B)/A×100%。

(5)

式(5)中：A为总细菌数，CFU/mL；B为未黏附的细菌数，CFU/mL。

1.3.4LGG的黏液黏附性能的测定

参照Liu等[7]的方法，使用细菌活性试剂盒对LGG菌悬液染色，制作肠切片，采用激光扫描共聚焦显微镜进行3D层扫，观察黏液中LGG吸附情况。

1.3.5党参多糖/海藻酸钠复合薄膜对LGG黏附作用的测定

1.3.5.1 CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2海藻酸钠复合薄膜的制备

各取0.3 g海藻酸钠分别溶解于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2(5 mg/mL，10 mL)水溶液中，空白组(BLK)不加糖，室温搅拌4 h，加入150 mg甘油，超声处理2 min去除气泡。各取10 mL溶液分别倒入直径为9 cm的塑料圆柱模具中，60 ℃烘干6 h。将膜取出，在50%湿度、25 ℃条件下放入烘干机中干燥48 h后备用。

1.3.5.2 复合薄膜对LGG的黏附作用的测定

将1.3.5.1中制备的各复合薄膜(1 cm2)与染色的LGG溶液(1 mL，4×108CFU/mL)合并，37 ℃孵育30 min，灭菌PBS冲洗3次后，用激光共聚焦显微镜观察。为计算黏附菌数，将相同数量的未染色的LGG与CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2膜37 ℃孵育30 min，用灭菌PBS冲洗3次后，将剩下的益生菌溶液全部镀到MRS琼脂培养基上，37 ℃孵育2 d。未黏附的益生菌细菌数采用平板计数法测定。LGG黏附于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2的黏附率根据1.3.3.4中式(5)计算。

1.3.6CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2与肠道黏液黏附作用的测定

1.3.6.1 流变学特性的测定

参照Huamani-Melendez 等[19]和Cohen等[20]的方法，各取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(5 mg/mL)加入至等体积的肠黏液中制成均匀混合物，于1 Hz频率下进行线性黏弹性区域内的振荡时间扫描。通过流变仪测定3种混合物在剪切速率为0.01～100.00 s-1条件下的黏度变化情况。

1.3.6.2 张力的测定

参照Liu等[7]的方法，取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(500 mg/mL)分别压缩于平面测试圆盘(d=10 mm)中，注射泵固定于天平上方。将大鼠的结肠组织固定于烧杯底部，注入PBS，使测试圆盘降至结肠组织表面，孵育20 min。注射泵滑块以2.83 mm/min的速度匀速上升，直至测试圆盘与结肠组织分离。每秒记录一次天平数据，计算最大分离力并按照梯形法则计算总黏附功。

1.4 数据处理与分析

所有数据以平均值±标准偏差表示；使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 多重比较分析，P<0.05表示差异显著；利用OriginPro 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 C-CPP-2和sC-CPP-2的结构表征

图1 CPP-2和C-CPP-2的FT-IR分析

C-CPP-2的羧基进一步与N-乙酰-L-半胱氨酸结合，进而将-SH连接到多糖的结构上，得到sC-CPP-2。-SH既能与细菌表面的黏液结合蛋白形成稳固的S-S，又能与肠道黏液层的半胱氨酸结合形成S-S[7-8]，连接细菌和肠道黏液，增加细菌的肠道黏附作用。经过巯基修饰之后，由式(3)计算得sC-CPP-2中巯基含量为 (279.50±5.97) μmol/g。CPP-2，C-CPP-2和sC-CPP-2中ζ-电位变化情况见图2。由图2可见，经羧基甲基化后，ζ-电位从-8.8 mV(CPP-2)下降到-67.5 mV(C-CPP-2)，sC-CPP-2则上升到-53.6 mV，表明sC-CPP-2成功修饰上巯基，且处于巯基和羧基共存状态。

不同小写字母表示组间差异显著。

2.2 sC-CPP-2对LGG的体外黏液及肠道黏附性的影响

2.2.1体外黏液黏附性分析

为研究sC-CPP-2是否能够增强LGG的体外黏液黏附作用，由式(4)计算分别添加生理盐水、CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2后LGG的黏附性，各组样品对LGG的黏附情况见图3。由图3可见，与NS组、CPP-2组和C-CPP-2组相比，sC-CPP-2对LGG的黏附作用显著增强。表明sC-CPP-2表面巯基与LGG表面蛋白质上的半胱氨酸残基形成二硫键，在LGG和黏液之间形成黏附作用，增加了黏液对LGG的黏附性；且sC-CPP-2与黏液之间的相互作用强度强于CPP-2与黏液之间的相互作用强度。C-CPP-2对益生菌的吸附率高于CPP-2，可能是由于C-CPP-2的羧基、羟基与肠黏液糖蛋白上唾液酸残基之间形成的氢键和离子键所致[25]。

不同小写字母表示组间差异显著。

2.2.2体外肠道黏附性分析

益生菌通过胃后，与肠道黏液的长期黏附是益生菌发挥其生理功能的先决条件[4]。利用体外肠道黏附实验进一步验证sC-CPP-2/LGG对LGG的黏附作用。各组样品对LGG的黏附情况见图4。由图4可见，与NS组、CPP-2组和C-CPP-2组相比，sC-CPP-2对LGG的黏附作用显著增强，可能是sC-CPP-2表面巯基与LGG和黏液之间形成共价键，增加黏液对LGG的黏附性。相比于体外黏液的黏附实验，NS组、CPP-2组和C-CPP-2组对LGG的体外肠道黏附作用更好，可能是其与LGG肠道黏液间存在氢键、范德华力等其他作用力的影响。

不同小写字母表示组间差异显著。

2.3 sC-CPP-2对LGG的肠道黏附性分析

LGG在肠道中的黏附情况CLSM观察结果见图5。由图5可见，CPP-2和C-CPP-2组有少量的LGG黏附到肠道，sC-CPP-2组的LGG黏附效果最佳，黏附数量最多。与CPP-2相比，sC-CPP-2和LGG之间的相互作用更强，这可能是因为sC-CPP-2和LGG之间存在二硫键。这一结果与体外黏液和肠道黏附实验相对应，再次证明sC-CPP-2可以增加LGG的肠道黏附性。Liu等[7]对魔芋葡甘聚糖的修饰也得到了与本研究相似的结果。

图5 不同党参多糖对LGG的肠道黏附性激光共聚焦观察结果

2.4 sC-CPP-2/海藻酸钠复合薄膜对LGG的黏附性分析

为进一步考察不同组复合薄膜对LGG的吸附作用，利用不同党参多糖与海藻酸钠形成复合薄膜，间接验证巯基化党参多糖对LGG的黏附性。由式(5)计算不同样品组对LGG的黏附率，实验结果见图6。由图6可见，BLK组、CPP-2组和C-CPP-2组对LGG均有一定的黏附作用，但巯基化修饰后的党参多糖sC-CPP-2对LGG的黏附率最大，表明sC-CPP-2聚合物与LGG之间的相互作用更强，对LGG有更强的黏附作用，这与2.2和2.3的实验结果一致。

不同小写字母表示组间差异显著。

同时，本研究还利用激光共聚焦显微镜对LGG在不同复合薄膜上的黏附情况进行了观察，结果见图7。由图7可见，sC-CPP-2/海藻酸钠组薄膜上吸附的LGG显著多于海藻酸钠组、CPP-2/海藻酸钠组和C-CPP-2/海藻酸钠组，说明sC-CPP-2/海藻酸钠薄膜对LGG有较强的黏附作用。染色的LGG在sC-CPP-2薄膜上的荧光强度高于其他组复合膜，进一步证实了LGG对sC-CPP-2/海藻酸钠薄膜的黏附性最强。此外，CPP-2/海藻酸钠薄膜在浸水后分解，而sC-CPP-2/海藻酸钠薄膜在浸水后保持完整，表明二硫键增强了膜的机械强度。sC-CPP-2可能通过其与黏液和益生菌的双重黏附作用，在肠黏膜中起到桥梁作用，从而将益生菌保留在肠黏膜中。

图7 激光共聚焦表征不同党参多糖/海藻酸钠复合膜对LGG的黏附性

2.5 sC-CPP-2与肠道黏液黏附性分析

2.5.1流变学测量结果

利用流变仪分析CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2与肠道黏液的相互作用关系，实验结果见图8。由图8(a)和图8(b)可见，在1 Hz的频率下，肠道黏液与CPP-2、C-CPP-2混合物的损耗模量G″均大于储能模量G′，表明混合物呈现黏性占优势的稀溶液性质，具有典型黏性流体特征。图8(c)显示，sC-CPP-2与肠道黏液的G′ 和G″在检测时间内出现了相交，混合物逐渐趋近于弹性占优势状态，说明sC-CPP-2与肠道黏液之间通过二硫键形成了具有黏弹性的凝胶网络，修饰过的党参多糖与肠道黏液的相互作用更强。CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2与肠道黏液混合物的表观黏度如图8(d)。图8(d)中，在0.01～100.00 s-1增速剪切过程中，3种混合物的表观黏度均随剪切速率的升高而降低，sC-CPP-2样品的表观黏度高于C-CPP-2样品和CPP-2样品，说明sC-CPP-2与肠道黏液的相互作用较强。

图8 肠道黏液与CPP-2、C-CPP-2、sC-CPP-2混合液的动态流变学特性和表观黏度分析

2.5.2拉伸实验测量结果

利用经典拉伸实验，记录各组样品从肠道表面分离时的分离力及黏附功的变化，实验结果见图9。由图9(a)可知，sC-CPP-2与黏液之间获得的分离力[(101.82±5.78) mN]是C-CPP-2与黏液之间获得的分离力[(71.54±4.60) mN]的近1.5倍，是CPP-2黏液之间获得的分离力的2倍[(49.53±3.90) mN]。由图9(b)可知，sC-CPP-2的黏附功[(120.07±6.81) μJ]明显高于C-CPP-2[(77.60±4.99) μJ]和CPP-2[(51.39±3.90) μJ]，再次证实了sC-CPP-2与黏液之间的黏合力最强。

不同小写字母表示组间差异显著。

3 讨 论

在肠道微生态失衡时，可通过食用外源性益生菌补充剂来重塑肠道菌群，改善疾病病症[26]。一般情况下，由于外源性益生菌肠道黏附性弱，与肠道固有菌群相比竞争力差，很多研究者将目光转向高黏附菌株的筛选。蔡红英[27]利用Caco-2细胞黏附实验从11株植物乳杆菌中筛选出具有降脂黏附性良好的植物乳杆菌FRT4和FRT10。占萌[28]从12株植物乳杆菌和2株耐久肠球菌中筛选出具有高黏附作用的嗜酸乳杆菌KLDS1.10901。然而，菌株筛选工作量大，且较难筛选出黏附特性好的理想菌株。如何在调节肠道菌群，改善肠道健康的同时，增加益生菌的肠道黏附作用，成为当前研究热点。

党参多糖具有益生元特性，可与益生菌结合促进宿主微生态调节，从而防治疾病[26]。巯基化修饰多糖可增强多糖的生物黏附性。前期实验结果表明，CPP-2可促进益生菌增殖，但经修饰后是否会影响CPP-2的益生特性还需验证。通过预实验发现，C-CPP-2和sC-CPP-2对益生菌的增殖作用与CPP-2无显著差异，说明对CPP-2进行羧甲基化和巯基化修饰并不会改变其对益生菌的增殖作用；且CPP-2经过羧甲基化修饰之后，红外光谱结果证实，修饰后的C-CPP-2仍保留多糖的结构特征。Li等[16]对羊肚菌多糖的羧甲基化和Wang等[11]对青钱柳多糖的羧甲基化也得到了与本研究相似的结果；尤其是在羧甲基化的衍生物中发现了多糖的特征峰，说明C-CPP-2虽然被成功羧甲基化，但并未显著改变其分子结构。因此，对CPP-2进行羧甲基化和巯基化修饰并不会改变其对益生菌的增殖作用。未来将利用微胶囊技术使益生菌和巯基党参多糖共包埋，构建小鼠急性结肠炎模型，进一步探究益生菌微胶囊对结肠炎的缓解作用，为实现益生菌在结肠内的增殖和黏附定植提供可能。

4 结 论

为构建益生菌与肠道黏液连接的桥梁，本研究对前期制备所得党参多糖CPP-2进行羧甲基化与巯基化修饰，得到sC-CPP-2；采用体外肠道黏附实验及与海藻酸钠形成的复合膜，检测sC-CPP-2对LGG和肠道黏液的黏附作用，并利用流变学和经典拉伸实验进行验证。结果显示，sC-CPP-2中巯基含量为(279.50±5.97) μmol/g，且处于巯基和羧基共存状态。sC-CPP-2/LGG能和黏液之间形成黏附作用，且sC-CPP-2与黏液之间的黏合力最强。sC-CPP-2能增加LGG的肠道黏附性，延长LGG在肠道内的停留时间，促进LGG的肠道黏附定植。希望本研究能够为解决外源性益生菌肠道黏附性差、定植难等问题提供参考。