TEMPO氧化- 高压均质联用制备柑橘纳米纤维素及其性质表征

陈 欢， 钟洪浩， 王鲁峰,2,*

(1.华中农业大学 食品科技学院， 湖北 武汉 430070；2.环境食品学教育部重点实验室， 湖北 武汉 430070)

纤维素是广泛存在于自然界的天然高分子化合物，可从多种植物中获得，由结晶区和无定形区组成，具有生物兼容性、可降解性、可持续性等特点[1]。物理、化学处理可破坏纤维素无定形区，形成直径小于100 nm的纳米纤维素[2]。研究发现纳米纤维素具有极其优异的特性，如高比表面积、可再生性、高比强度和刚度、对环境友好等[3]，已被广泛应用于复合材料、生物医疗、食品原料领域[4]。

目前，纳米纤维素的制备主要通过机械破碎的方式[5]。但该方法耗能较大。通过化学方法或酶法对纤维素进行预处理后再进行机械破碎能有效降低生产能耗[6]。 2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)氧化在温和的水浴环境中进行，反应完成后，对纤维素进行简单的机械处理就可获得纳米纤维素，极大减少了单纯机械处理需要的能源[7]。Pinto等[8]通过TEMPO氧化与超声处理后成功得到了甘蔗渣纳米纤维素。但目前关于TEMPO氧化对纤维素功能性质影响的研究还不够全面，且尚未见到TEMPO氧化技术在柑橘纳米纤维素制备方面的应用。本研究考虑将TEMPO氧化技术与高压均质技术联用制备柑橘纳米纤维素，以期达到降低能耗的目的。

柑橘作为全球最受欢迎的水果之一，大量的皮渣被当作废弃物丢弃，全世界每年大概会产生1.1～1.2亿t柑橘废料，造成了严重的环境污染[9]。而柑橘皮渣中含有大量的膳食纤维，具有优异的功能特性(如持水性)，不仅能增加食品的黏度，还能用作乳化剂改善食品品质[10]。柑橘膳食纤维中含有丰富的纤维素，可作为纳米纤维素资源开发利用。Hideno 等[11]以橘皮为原料，通过酶联合研磨处理制备了宽度为10～50 nm的纳米纤维素。本研究以柑橘皮渣为原料，通过TEMPO氧化和高压均质制备柑橘纳米纤维素。考察了不同氧化剂质量摩尔浓度下柑橘纤维的形貌特征和理化性质，以期为柑橘废弃物的回收再利用提供新的思路，为纳米纤维素的制备提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘皮渣粉末，西安全奥生物科技有限公司；大豆油，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司； TEMPO，上海源叶生物科技有限公司；NaBr、NaClO、HCl、NaOH等，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；胆固醇试剂盒，南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Allegra X- 30R型离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；AH- 2010型高压细胞匀浆机，加拿大安拓思纳米技术有限公司；Zetasizer Nano ZS型纳米粒度电位仪，英国马尔文仪器有限公司；Multimode 8型原子力显微镜(AFM)、D8 Advance型X射线衍射仪，德国布鲁克公司；SU8010型扫描电镜(SEM)，日本日立公司；Nicolet IS50型傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；Thermo plus EVO2型热重分析仪，日本理学株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1柑橘可溶性膳食纤维的去除

参考涂晓丽等[12]的方法去除柑橘皮渣中的可溶性膳食纤维。将柑橘皮渣粉末与0.1 mol/L 盐酸水溶液以料液比(g/mL)1∶10混合，于90 ℃下水解90 min，反应结束后离心(5 000 r/min、10 min)并弃去上清液。下层沉淀用去离子水反复冲洗3次以去除溶出的可溶性膳食纤维。用0.1 mol/L NaOH溶液将pH值调至中性，离心去除上层清液后冻干粉碎，过80目筛即得柑橘水不溶性膳食纤维样品，室温下储存备用。

1.3.2柑橘纳米纤维素的制备及产率计算

准确称取1 g柑橘水不溶性膳食纤维样品、0.016 g TEMPO和0.16 g NaBr于100 mL去离子水中并充分搅拌。加入一定体积的有效氯质量分数为12%的NaClO溶液，使其质量摩尔浓度为5、25、50 mmol/g。反应过程中不断滴加0.5 mol/L NaOH，以维持体系pH值在10.0±0.2。30 ℃反应4 h后，加入10 mL无水乙醇终止反应，用0.5 mol/L HCl调节pH值至中性。离心(8 000 r/min、10 min)取下层沉淀并依次用乙醇(体积分数95%)和去离子水反复冲洗3次以去除体系中多余的盐。随后，将沉淀分散在100 mL去离子水中，在高压均质机中以50 MPa的压力均质10次，离心(10 000 r/min、10 min)后取上层悬浮液冻干，即得柑橘纳米纤维素。将未经氧化均质处理的样品命名为T0，经TEMPO氧化均质后得到的3种纳米纤维素样品分别命名为T1(5 mmol/g)、T2(25 mmol/g)、T3(50 mmol/g)。纳米纤维素产率按式(1)计算。

(1)

式(1)中，m1为氧化前柑橘水不溶性膳食纤维质量，g；m2为制得的柑橘纳米纤维素的质量，g。

1.3.3柑橘纳米纤维素粒径测定

将1 mg T0、T1、T2、T3样品分别分散至10 mL去离子水中，超声处理15 min后用纳米粒度电位仪测定粒径。

1.3.4柑橘纳米纤维素原子力显微镜观察

将T0、T1、T2、T3样品悬浮液用去离子水稀释至0.01 mg/mL，经超声分散处理后滴加至云母片上并风干。风干后的样品置于AFM下，以轻敲模式观察样品的微观形态。

1.3.5柑橘纳米纤维素扫描电镜观察

将T0、T1、T2、T3样品粘在导电样品台上，经喷金处理后，置于SEM载物台上，放大5 000倍以观察纤维的表面形态。

1.3.6柑橘纳米纤维素红外光谱分析

分别将T0、T1、T2、T3样品与KBr以质量比1∶100的比例混合，研磨至细微颗粒后压成透光薄片，置于傅里叶变换红外光谱仪中，以4 cm-1的分辨率，在400～4 000 cm-1检测。

1.3.7柑橘纳米纤维素X射线衍射分析

通过X射线衍射仪测定T0、T1、T2、T3样品的结晶度。设定工作电压为30 kV，工作电流为20 mA，衍射角扫描范围为5°～40°，扫描速度为2°/min。根据Segal公式对样品的结晶度指数进行计算。

1.3.8柑橘纳米纤维素热重分析

分别称取10 mg左右的T0、T1、T2、T3样品，利用热重分析仪在氮气环境下记录样品热稳定性。设置升温速率为10 ℃/min，温度扫描范围为30～600 ℃。

1.3.9柑橘纳米纤维素理化特性测定

1.3.9.1 持水力测定

将0.2 g T0、T1、T2、T3样品与20 mL去离子水在室温下水合2 h后，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液并用滤纸将残留水分吸干。柑橘纳米纤维素的持水力(WHC)(g/g)按式(2)计算。

(2)

式(2)中，W1为吸水前的样品质量，g；W2为吸水后样品的质量，g。

1.3.9.2 持油力测定

将0.2 g T0、T1、T2、T3样品与20 mL大豆油在室温下充分混合2 h后，8 000 r/min离心10 min，弃去上层油液，并用滤纸吸干残留油液。持油力(OHC)(g/g)按式(3)计算。

(3)

式(3)中，M1为吸油前的样品质量，g；M2为吸油后样品的质量，g。

1.3.9.3 胆固醇吸附力测定

胆固醇吸附力(CAC)的测量参照刘晓贺等[13]的方法进行。将蛋黄(10 mL)与蒸馏水(90 mL)充分混合均匀并搅打成乳液。取0.1 g T0、T1、T2、T3样品与8 mL搅打好的乳液充分混合并置于37 ℃摇床中振摇2 h，于8 000 r/min离心10 min，收集上清液。按照胆固醇试剂盒说明书进行胆固醇含量的测定，按式(4)计算柑橘纳米纤维素胆固醇吸附能力(mg/g)。

(4)

式(4)中，m1为吸附前胆固醇的质量，mg；m2为吸附后胆固醇的质量，mg；m为纳米纤维素样品的质量，g。

1.3.9.4 葡萄糖吸附力测定

葡萄糖吸附力(GAC)参照Gan等[14]的方法进行。将0.1 g T0、T1、T2、T3样品与8 mL葡萄糖溶液(0.5 mg/mL)于37 ℃下充分混合2 h，8 000 r/min离心10 min。利用分光光度计在520 nm处测量上清液中的葡萄糖含量，按式(5)计算葡萄糖吸附能力(mg/g)。

(5)

式(5)中，m1为吸附前葡萄糖的质量，mg；m2为吸附后葡萄糖的质量，mg；m为纳米纤维素样品的质量，g。

1.4 数据处理

所有实验均设置3次平行，利用SPSS 13.0和Graph pad prism 8.0进行数据分析和绘图。所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 柑橘纳米纤维素粒径分析与原子力显微镜观察结果分析

图1和表1显示了T0、T1、T2、T3样品的AFM显微图像和尺寸信息。由图1可以看出，所有的样品均相互缠绕成网状并呈现出典型的丝状。这种聚集表现出纤维素链之间的分子间氢键和强亲水相互作用[15]。而随着氧化剂质量摩尔浓度的升高，制备的纳米纤维素体现出略微分离的状态，这可能是因为氧化剂加速了纤维素的溶胀，进一步促进了其在均质作用下的断裂[8]。由表1可知，随着氧化剂质量摩尔浓度的提高，纤维素的长度由大于2 μm减少为(150.57±24.99) nm，直径由大于2 μm下降至(2.74±0.29) nm，平均粒径由大于10 μm减小为(540.70±31.29) nm，但纳米纤维素的产率随着氧化剂质量摩尔浓度的上升而下降，并在质量摩尔浓度为50 mmol/g时降至(35.14±3.25)%。纳米纤维素的平均粒径大于直径，是因为在平均粒径的测量过程中，纳米纤维素的聚集导致了平均粒径的增加。纳米纤维素直径和长度的减少是由于在氧化过程中，纤维素分子中的羟基会被氧化为羧基，羧基所带的负电荷之间的斥力会促进纤维素的分离。并且氧化剂质量摩尔浓度的增加提高了体系中的电荷密度，大量负电荷的引入一方面使纳米纤维素的分离更加容易；另一方面，纳米纤维素产生的强静电排斥也促进了高压均质过程中的除颤，进一步导致了更短的纳米纤维素的产生[2]。

图1 柑橘水不溶性膳食纤维及柑橘纳米纤维素的AFM观察结果

表1 柑橘纳米纤维素的粒径变化

2.2 柑橘纳米纤维素扫描电镜观察结果分析

柑橘水不溶性膳食纤维经氧化均质处理后，纤维的微观结构和表观形态都会发生极大的变化。图2为柑橘水不溶性膳食纤维氧化均质处理前后样品的微观图像。由图2可以看出，未经处理的柑橘水不溶性膳食纤维表面较为光滑，大量的纤维聚集在一起。这可能是由于未经氧化的纤维体系中含有的半纤维素和木质素具有黏合作用[16]。而经不同质量摩尔浓度的氧化剂处理后，纤维变为细长的条状结构；且氧化剂质量摩尔浓度越高，纤维表面越粗糙。这是由于在次氯酸钠的作用下，柑橘水不溶膳食纤维中的半纤维素和木质素被氧化降解，变为水溶性物质溶出，柑橘中的纤维素纤维被充分释放出来，表现出更为粗糙的表观结构[17]。同时可以发现，T1的SEM照片中仍有小部分的纤维粘在一起，说明5 mmol/g氧化剂并不能完全打破柑橘水不溶膳食纤维的细胞结构，体系内仍存在木质素、半纤维素黏合剂，使纤维分子在纤维素酯等桥键的作用力下聚集在一起[18]。

图2 柑橘水不溶性膳食纤维及柑橘纳米纤维素的SEM图

2.3 柑橘纳米纤维素红外光谱分析

图3 柑橘水不溶性膳食纤维及柑橘纳米纤维素的红外光谱

2.4 柑橘纳米纤维素X射线衍射图谱分析

图4为样品的X射线衍射(XRD)图谱。由图4可知，经氧化均质处理后，样品T1、T2和T3在2θ为15.5°和22.5°时，都有明显的衍射峰出现，分别代表了纤维素Ⅰ型结构的(101)和(002)晶面[21]，说明了柑橘纤维素的晶型结构并不会受到TEMPO氧化反应的影响。而T0样品中出现的杂乱的衍射峰，可能是样品中存在的无定形区物质，如木质素、半纤维素等引起的。

图4 柑橘水不溶性膳食纤维及柑橘纳米纤维素的XRD结果

通过Segal公式计算得样品T0、T1、T2、T3的结晶度指数分别为10.74%、49.58%、66.70%、54.15%。T1、T2和T3的结晶度指数明显高于T0，这是由于TEMPO氧化处理后，柑橘水不溶性纤维无定形区的半纤维素和木质素被水解溶出，进而提高了结晶度[15]。T1的结晶度为49.58%，T2的结晶度为66.70%，结晶度略有提高，这是氧化剂质量摩尔浓度的上升使样品中的半纤维素和木质素被去除的结果，这与Pinto等[8]的结果相似。同时，与T2相比，T3的结晶度指数出现了明显的下降，这是由于TEMPO氧化过程中，纤维素结晶区被破坏。在氧化过程中，氧化剂一方面将纤维素分子中的羟基转变为羧基；另一方面，随着氧化剂质量摩尔浓度的提高，纤维素的结晶区在反应过程中也充分溶胀，进而在均质过程中巨大剪切力的作用下，分子中的羧基断裂，结晶区被破坏[20]。XRD结果说明：TEMPO氧化可有效提高柑橘水不溶性纤维样品的结晶度，随着氧化剂质量摩尔浓度的提高，柑橘纳米纤维素的结晶区也会被溶胀破坏。该结果与SEM的结果一致。在氧化剂质量摩尔浓度较低时，无定形区未被完全去除，这些无定形纤维素包裹纤维素形成聚集体，表现为光滑的表观结构；而当氧化剂质量摩尔浓度升高，纤维素样品结晶区被部分破坏，在反应过程中这部分结晶区的体积被水分子占据，真空去除后，剩余的纤维素表面脱水并裸露出来，表现为更为粗糙的表观结构[22]。

2.5 柑橘纳米纤维素热重分析

热重(TG)分析是研究材料热降解的有效方式。通过热重分析，可更全面地了解柑橘纳米纤维素的应用范围。T0、T1、T2、T3样品的TG曲线与微分热重(DTG)曲线如图5。由图5可知，样品的失重发生在50～600 ℃，主要分为50～150 ℃、150～350 ℃、400～600 ℃这3个阶段。第一阶段的失重主要是样品中水分蒸发和低分子质量化合物的分解引起的[23]。在150～350 ℃时，所有样品均有一个较大幅度的质量损失，这主要是柑橘纤维如纤维素自身的热降解导致的[10]。T0、T1、T2、T3的初始降解温度分别约为190、249、228、220 ℃，该结果说明TEMPO氧化和均质处理可有效提高柑橘纤维的热稳定性。柑橘水不溶性膳食纤维经氧化均质处理后，纤维中的半纤维素和木质素等无定形成分被水解去除，纤维的结晶度指数上升，耐热性也进一步提升。T1的热降解温度高于T2、T3，这是由于随着氧化剂浓度的提高，T2、T3表面产生了更多的羧基，羧基基团的存在影响了纳米纤维素的导热性，从而降低了柑橘纳米纤维素的热稳定性。T2的热降解温度大于T3，一方面是羧基的影响；另一方面，这也是均质过程中纤维素结晶区被部分破坏的结果。400～600 ℃的质量损失主要是纤维素分子链降解造成的[24]。T0、T1、T2、T3的残留质量分数分别为30.25%、7.33%、16.00%、17.42%。 T1的残留质量分数显著小于T2、T3，可能是因为TEMPO氧化后纤维表面大量存在的羧基基团影响了纤维的导热性，导致了其残留量的上升，这与周昌兵等[25]对于剑麻纤维素纳米纤维的研究结果相似。同时，通过DTG曲线可以看出，T1的热降解速率最大(14.06%)，T2为10.31%，T3为9.05%，而T0为8.90%，这是因为T0样品中存在大量木质素，木质素会导致分解速度变慢，使得T0的热降解更困难[2]。而随着氧化剂质量摩尔浓度的进一步提高，T2、T3样品中的半纤维素和木质素被全部去除，与T1相比结晶度上升，聚合度增加，热降解变得困难，降低了热降解速率。这与XRD结果一致，表明TEMPO氧化均质处理可提高柑橘水不溶性膳食纤维的热稳定性。

图5 柑橘水不溶性膳食纤维及柑橘纳米纤维素的TG和DTG分析

2.6 柑橘纳米纤维素理化特性分析

2.6.1持水力与持油力分析

高持水力的纳米纤维分散到食品体系中，可提高食品体系黏度，防止食物收缩[14]。不同氧化处理的柑橘纳米纤维素样品的持水力和持油力如图6。由图6(a)可以看出，与未经氧化均质处理的柑橘水不溶性膳食纤维持水力[(6.59±0.13) g/g]相比，处理后的柑橘纳米纤维素的持水力显著上升，并随着氧化剂质量摩尔浓度的升高而提高，在NaClO质量摩尔浓度为50 mmol/g 时达到(42.13±0.61) g/g。这可能是氧化均质过程使纤维结构变得松散，表面变得粗糙，柑橘纳米纤维素结晶区被破坏，亲水基团暴露导致的。同时，T1的持水力显著低于T2与T3，还可能是因为T1中含有的半纤维素和木质素等杂质，这与SEM、红外光谱分析结果吻合。

具有高持油力的纤维可稳定高脂肪食品和乳液，促进2种不混溶溶液的溶解或分散[6]。由图6(b)可知，T0的持油力为(4.50±0.10) g/g。随着氧化剂质量摩尔浓度的提高，在剪切力的作用下，纳米纤维素结构被破坏，长度进一步减小，纳米纤维素呈现出更为粗糙的表观结构，T3样品表现出最高的持油力[(46.84±1.78) g/g]，远大于通过蒸汽闪爆技术制备的小麦纳米纤维素的持油力[26]。这些结果表明，柑橘纳米纤维素成分、比表面积和表观粗糙度等结构会显著影响其持水力和持油力。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.01)。

2.6.2胆固醇吸附力分析

纤维的胆固醇吸附能力可有效降低人体血浆中的胆固醇含量，减少心血管疾病的发生[27]。不同氧化处理后的柑橘纳米纤维素的CAC见图7。由图7可知，T0的吸附力为(13.80±0.70) mg/g，T1、T2、T3的吸附力分别为(23.36±0.20)、(25.36±0.17)、(35.65±0.22) mg/g。可以看出，随着氧化剂质量摩尔浓度的升高，纳米纤维素的胆固醇吸附力也逐渐上升，并在氧化剂质量摩尔浓度为50 mmol/g时达到最大。这说明了柑橘纳米纤维素的胆固醇吸附力与纤维的粒径、长度以及表面粗糙度有关，直径越小，比表面积越大，表面结构越粗糙，胆固醇的吸附位点越多，越能捕获体系中的胆固醇，胆固醇吸附力也就越强。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.01)。

2.6.3葡萄糖吸附力分析

葡萄糖吸附力是纤维素一个非常重要的功能性质，纤维素与肠液中的葡萄糖结合可降低摄食后人体的血糖水平[14]。不同氧化处理的柑橘纳米纤维素的葡萄糖吸附力如图8。所有的样品均能有效地吸附体系中的葡萄糖，T0的吸附力为(3.35±0.05) mg/g，T3表现出最强的吸附能力[(16.27±0.04) mg/g]，约为T0的4倍。结果表明：经氧化均质处理后的柑橘纳米纤维素对于葡萄糖具有极强的吸附力，具有潜在的降血糖作用。尽管如此，柑橘纳米纤维素的葡萄糖吸附力还是低于文献报道的柑橘膳食纤维的吸附能力，如Gan等[14]发现微波- 超声处理后的柑橘可溶性膳食纤维的葡萄糖吸附力为(24.42±0.06) mg/g。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.01)。

3 结 论

本研究以柑橘皮渣为原料，通过TEMPO氧化- 高压均质联合处理制备柑橘纳米纤维素。随着NaClO质量摩尔浓度的增加，柑橘纳米纤维素的结构、表观形态以及理化性质都有不同程度的变化。粒径测定与AFM结果表明：NaClO质量摩尔浓度的升高，使柑橘纳米纤维素的平均粒径、直径和长度都显著降低，这是由于氧化剂质量摩尔浓度升高后，纤维素被充分溶胀，增强了均质过程中的除颤效果。SEM的结果显示：在高质量摩尔浓度的氧化剂体系中，纳米纤维素表面表现得更粗糙，这是纤维中半纤维素和木质素的去除导致的，该结论在红外光谱分析的结果中也得到了证实。同时，XRD结果表明：获得的柑橘纳米纤维素为纤维素Ⅰ晶体结构，NaClO质量摩尔浓度的增加并不会改变其晶型结构，但在高质量摩尔浓度下(50 mmol/g)，柑橘纳米纤维素的结晶度和热稳定性都有轻微降低，这是纤维素的结晶区氧化时被充分溶胀，在剪切力的作用下，结晶区被部分破坏导致的。柑橘纳米纤维素的理化性质分析结果表明：NaClO质量摩尔浓度的增加可有效提高制得的纳米纤维素的持水力、持油力、胆固醇吸附力和葡萄糖吸附力，在NaClO质量摩尔浓度为50 mmol/L时，与未处理的柑橘水不溶性膳食纤维相比，纳米纤维素持水力、持油力、胆固醇吸附力、葡萄糖吸附力分别提高了约7、10、4、3倍。本研究证实了TEMPO氧化均质联用法制备柑橘纳米纤维素的可行性，可为柑橘纳米纤维素的分离提供一种高效低能耗的方法。且该方法制备的柑橘纳米纤维素具有优异的功能性质，在食品行业具有较大的应用潜力，希望有利于实现柑橘副产物的高值化利用。