两个CBA 亚系流产模型数据比较

2022-08-01 05:59蕾吴旭颖高玉龙张文明李斌刘云波
中国比较医学杂志 2022年6期
关键词:造模胎盘胚胎

王 蕾吴旭颖高玉龙张文明李 斌刘云波

(1.北京华阜康生物科技股份有限公司,北京 102202;2.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京 100021)

CBA 和DBA/2 是较常用的两个小鼠近交品系。CBA(雌性)和DBA/2(雄性)交配组合具有易患反复自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)的特点。 近年来这一组为RSA 动物模型,其重要价值在国际上正逐步引起重视,近些年在国内逐渐引起关注[1],参考文献报道CBA(雌性)和 DBA/2(雄性)交配胚胎吸收率21%~56%[2],各家文献差异较大。

本公司有两种CBA 品系,一种CBA/J,一种CBA/Ola。 CBA/J 小鼠是1920 年由Strong 用Bagg白化雌鼠与DBA 雄性鼠交配后进行近交培育,1947年引到Andervont 处,1948 年引到JAX[3]。 CBA/Ola小鼠是1983 年从JAX 引到OLAC,1985 年由OLAC引到IMLAS[4]。 CBA/Ola 亚系虽然来源于CBA/J,但是通过长期的选育形成不同的亚系。

本研究对CBA/J 和CBA/Ola 小鼠的自然流产模型造模情况进行观察比较。 自然流产是指胚胎或胎儿因某种原因自动脱离母体,终止妊娠而排出。 胚胎吸收是由于小鼠子宫的特殊结构,由于某种原因胎儿停育,而不会出现出血和流产,但是胎儿被母体吸收,却不影响其他胚胎的妊娠。 根据小鼠这种特殊生理情况,研究小鼠自然流产模型造模情况主要观察胚胎吸收率、胚胎吸收数量、胎盘直径大小和体积等[5]。

1 材料和方法

1.1 实验动物

流产模型实验动物为SPF 级,详见表1,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京)2019-0008]。 实验小鼠均饲养在北京华阜康生物科技股份有限公司屏障环境(隔离器)内[SYXK(京)2019-0022],隔离环境为洁净度5 级,温度(24±2)℃,相对湿度(50±10)%,换气次数为每小时20次,明暗周期为12 h:12 h,动物自由采食和饮水,饲料为华阜康生产的60Co 辐照灭菌的鼠繁殖料1035。所有动物实验均经过北京华阜康实验动物伦理委员会审批(HFKIACUC-20190321),符合动物伦理学要求和实验动物保护的相关规定,实验动物饲养和实验过程中做到实验动物使用的3R 原则,并给予实验动物人道关怀。

表1 流产模型实验动物Table 1 Experimental animals of abortion model

饮用水为酸化过滤自来水(pH=2.7~3.0)并经高压蒸汽灭菌30 min(121℃)。 所用笼具、垫料、水瓶等物品均经过高压蒸汽灭菌 30 min(132℃),每周更换垫料1 次,进出隔离器的物品均应进行消毒处理,操作严格遵守隔离系统规程。

1.2 主要试剂与仪器

75%乙醇购自山东利尔康医疗科技股份有限公司,批号20210101。

Canon 单反数码相机,型号EF-S 18-55 mmU;上匠游标卡尺(0~150 mm),型号SJ455515,用于测量胎盘的直径;手术器械,用于解剖怀孕14 d 小鼠。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

为了研究两个CBA 亚系(CBA/J 和CBA/Ola)流产模型的造模情况,分别对2 个周龄(10 周和16周)雌鼠的造模情况进行研究。 每个周龄又设计3组,分别为1 组:本品系互配组CBA♂×CBA♀;2组:流产模型对照组BALB/c♂×CBA♀;3 组:流产模型实验组DBA2♂×CBA♀。

1.3.2 实验步骤

雌性CBA 小鼠饲养在雄鼠脏垫料中,2~3 d 后挑选发情的雌性小鼠按照上述分组合笼。 详细操作为:实验当天下午挑选发情的CBA/J 和CBA/Ola雌鼠,17:00 放入雄鼠的笼盒中,互配10~12 h 检查阴道栓。 见栓为怀孕0.5 d。 继续按照互配分组饲养13.5 d 后,进行解剖、拍照、胎盘直径测量。 对各组动物见栓及怀孕、胚胎吸收情况进行统计;对各组胎盘直径进行测量和统计分析及胚胎吸收的判定。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析。 数值以平均数±标准差(±s)表示,以P<0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 各实验组见栓、怀孕、胚胎吸收情况

由于挑选发情雌鼠时间跨度长(本实验从2021年3 月24 日开始,2021 年5 月20 日结束),所以10周组数据为9~15 周雌鼠数据,16 周组数据为15~21 周雌鼠数据。 各组配动物见栓及怀孕、胚胎吸收情况见表2。

表2 各组配动物见栓及怀孕、胚胎吸收情况Table 2 Embolism, pregnancy and embryo absorption in each group of mice

2.2 各实验组胚胎直径及体积数据分析

解剖观察CBA/J 与CBA/Ola 各周龄雌鼠胚胎吸收外观特征相似。 剖开可见未完全吸收的胎盘,胚胎已经消失。 正常14 d 胚胎全部大小基本一致(长:0.8~1 cm;宽0.4~0.5 cm),但是胚胎长和宽也会随着胎儿数量的多少而稍微有些变化,观察到如果胎儿数量多则胚胎偏小,数量少则胚胎偏大。

用游标卡尺测量胎盘直径,并做好记录,用组间单因素方差分析检验对各组胎盘的直径数据进行测量和统计分析,各组之间比较,10 周CBA/Ola 2组胎盘直径显著长于10 周CBA/Ola 1 组和3 组(P<0.05);16 周CBA/Ola 2 组胎盘直径显著长于16周CBA/Ola 1 组和3 组(P<0.05)。 其余组间未见显著差异(见表3)。 有报道胎盘体积=πd3/6,小于同孕龄胎鼠胎盘单位平均体积减去 2 个标准差者判为体积明显缩小,判定为胚胎丢失[5]。 按照上述公式计算出胎盘体积(见表3)。

表3 各组正常胎盘直径及体积数据Table 3 Nomal placenta diameter and volume datas of each group

通过胎盘体积计算和统计,10 周CBA/J 3 组显著高于本组其他两组(P<0.05),10 周CBA/Ola 2 组显著高于本组其他两组(P<0.05),16 周CBA/Ola 2 组显著高于本组其他两组(P<0.05)(见表3)。 有报道指出新生儿出生体重正常者较低体重者,其胎盘体积较大[6]。 胎盘体积可能与胎儿数量及体重有关。

对吸收胎盘的直径进行数据分析,只有16 周CBA/J 3 组胚胎吸收胎盘直径显著高于本组其他组(P<0.05),其他各组间差异不显著(见表4)。 对胚胎吸收胎盘平均体积进行数据分析,只有16 周CBA/J 3 组胚胎吸收胎盘体积显著高于本组其他组(P<0.05)。

表4 各组胚胎吸收胎盘直径及胎盘体积数据Table 4 Absorbed placenta diameter and volume datas of each group

从表4 数据可以看出,参考文献[5]中的判断方法可取。 但是发现10 周CBA/Ola1 组胚胎吸收胎盘直径数据计算的胎盘体积按照文献判断方法,体积大于平均值减去两个标准差,本品系互配发现的胚胎吸收情况,原因可能与CBA 品系的背景基因有关,还需要进一步研究。

3 讨论

与雄性DBA/2 小鼠(H-2d)交配后的雌性CBA 小鼠(H-2k)的流产率高达20%~30%,而且这种流产具有隐性、反复性和父系特异性的特征;在同为H-2k×H-2d 交配方式的CBA×BALB/c 中,孕鼠的胚胎吸收率仅为5%~10%。 这个发现为深入研究妊娠这一复杂生理现象提供了两个经典的动物模型[1]。

大多关于自然流产模型的一般认为母胎界面的免疫异常导致的[7-13]。 而且通过观察发现,CBA/J 雌鼠比CBA/Ola 雌鼠造模率高。 CBA/J 16周雌鼠比CBA/J 10 周雌鼠造模率高,这与相关文献报道一致[14]。 此外有报道指出环境越洁净,造模率越高[15]。 造模第一胎流产率小,第二胎流产率增加[2]。 但是一般实验很少用二胎来进行。

还有报道指出DBA2 存在天然的Klrd1(CD94)缺失,笔者认为与流产模型的造模机理有一定的关系[14]。

本研究进一步探讨两个CBA 两个亚系流产模型数据比较,流产模型的造模机理较复杂,还需要进一步研究,本文为科学研究提供快速建模的数据支持。

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