纳米硒抗菌的研究进展及其应用

杨超群，陈璨羽，木拜西尔·麦麦提依明，刘 静，邓国英

(1.上海市第一人民医院创伤中心，上海 201620；2.上海交通大学基础医学院，上海 200025；3.上海交通大学材料学院，上海 200240)

近年来，医院内获得性感染和细菌的抗菌药物耐药问题日趋严重，给医疗卫生行业带来了巨大挑战。发展中国家医院感染发生率高达15.5%[1]，直接影响患者尤其是住院患者的预后。而多重耐药菌的出现更加剧了此窘况。据预测，到2050年因多重耐药菌而死亡的人数将增加到每年1 000万人，造成全球GDP损失达100万亿美元[2]。可见，抗菌问题仍困扰着当下的医疗行业，尤其是在后抗生素时代，抗生素的作用逐渐弱化，迫切需要寻找新的抗菌机制，开发新型抗菌药物。目前，国内外诸多学者致力于将纳米材料发展为抗菌的新手段。相较于抗菌药物，纳米材料具有体积小、表面积大、易于吸收降解等优点[3]，有利于提高药物输送效率、增强疗效、防止多重耐药菌的产生。目前，关于纳米材料抗菌效能的研究主要集中于金、银等颗粒，但是，这些材料不仅具有较强的细胞毒性、长时间接触还会导致炎症细胞因子增加，可能诱导抗菌药物耐药基因的转移和新型突变[4]。

而硒作为人体内必需的微量元素，已广泛应用于抗肿瘤、抗氧化应激等领域[5]。相较于有机或无机形态的硒化合物，纳米硒(SeNPs)具有更高的生物安全性[6]。试验表明，SeNPs对人真皮层纤维细胞没有显著毒性，不易引起红细胞溶血，具有较强的细胞相容性和血液相容性[7]。SeNPs除了能负载抗菌药物，本身即有良好的抗菌作用，其在抗菌领域具有可观的研究潜力。基于此，已有较多学者聚焦于SeNPs的抗菌活性及其机制，并通过研究表面修饰物来合成改良的SeNPs材料，以期达到增强疗效，降低不良反应等目的。但国内对SeNPs抗菌效能的报道仍较少，尚无文献系统陈述其抗菌机制。因此，本文依据现有的研究对影响SeNPs的抗菌活性因素、抗菌机制和改良SeNPs材料的研究进展进行综述，并对其临床应用进行阐述与展望，以期为抗菌材料的研究和临床应用提供参考。

1 SeNPs抗菌活性及其影响因素

1.1 SeNPs的抗菌活性 目前，研究[7-8]表明，SeNPs能有效抑制常见的医院感染菌，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等，对肺炎克雷伯菌等棘手的多重耐药菌也呈现出良好的预防与治疗效果。Dorazilová 等[9]合成的材料展现了良好的抗耐药菌能力，浓度为10 mg/L时，其对耐药菌株抑制率可达85%。此外，SeNPs还能有效预防和清除细菌致病性和耐药性相关的生物膜。生物膜是细菌通过分泌细胞外聚合物形成的高度组织化的膜状结构，能够抵抗抗菌药物、杀菌剂；同时，生物膜中的细菌常处于休眠状态，代谢不活跃，对不良环境的耐受能力较强[10]。生物膜常附着于医疗卫生器械上，难以清除，而现有的抗菌药物中尚无有效治疗方案[11]。相较于抗菌药物，SeNPs能直接作用于细菌细胞壁，从而预防细菌生物膜形成并清除已形成的生物膜[12]。Shakibaie等[13]报道，SeNPs能有效抑制重要医院感染病原菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌的生物膜形成。Cremonini等[14]试验表明，SeNPs能有效降解铜绿假单胞菌的细菌外多糖基质，从而抑制生物膜合成。当SeNPs浓度为50～100 μg/mL时，抑制率高达70%～90%，降解率为50%～70%。可见，SeNPs在抗多重耐药菌和细菌生物膜等方面展现出良好的应用价值，将是未来研究的重点。

1.2 影响SeNPs的抗菌活性因素 研究已证明SeNPs的强抗菌活性，但是不同研究中SeNPs的抗菌活性具有一定的差异。有学者推断，此差异性主要与SeNPs的颗粒特性和合成方式有关[15]。

1.2.1 SeNPs的颗粒特性 目前关于SeNPs粒径大小和其抗菌特性的具体关系仍未阐明，有研究[16]提出，SeNPs的粒径越小其抗菌活性越强，但在该研究中，SeNPs颗粒粒径整体较大，不足以支持此推论。为此，研究[15]制作了尺寸为40～200 nm的球形SeNPs，比较不同直径的SeNPs抗菌活性，结果表明，81 nm的SeNPs对金黄色葡萄球菌抑菌和杀菌能力最强。可见，SeNPs的抗菌能力与其粒径相关，但非简单的线性关系，具体机制仍待进一步研究。此外，SeNPs的抗菌作用与浓度相关。研究[17]比较四组不同浓度SeNPs的抗菌活性，随着浓度增加，抑菌圈逐渐增大，且均高于加入氢氧化钙、氯己定和次氯酸钠组。Dorazilová等[9]试验评估SeNPs-壳聚糖支架抗伤口感染情况，发现浓度为1 mg/L的材料对金黄色葡萄球菌的抑制率为14%，而5、10 mg/L的抑菌率则分别增长至33%、75%。因此，SeNPs的抗菌作用具有一定的浓度依赖性，在临床应用中也需结合其细胞毒性等综合考虑，实际应用中的最佳浓度仍待进一步研究。

1.2.2 SeNPs的合成方式 研究表明，SeNPs的抗菌活性与其合成方式有关。Piacenza 等[18]研究用蕈状芽孢杆菌还原亚硒酸盐生成了生物SeNPs，用L-半胱氨酸或抗坏血酸生成化学SeNPs，对比两者抗铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的能力，发现生物SeNPs对两种菌株的有效抗生物膜活性浓度为0.078、0.312 5 mg/mL。而即便是最高测试浓度(2.5 mg/mL)的化学SeNPs，抗菌活性仅为中等。鉴于微生物合成步骤复杂，有研究尝试用植物合成SeNPs。Alam等[19]用番石榴叶的乙醇提取物还原亚硒酸钠得到了一种大小在8～20 nm的SeNPs，经过抗菌活性检测发现，其抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为23、11.7 μg/mL，而化学SeNPs的MIC值为31 μg/mL。植物合成的SeNPs与地衣芽孢杆菌合成的SeNPs抗菌能力相当，安全性更佳。因此，不同的合成方式直接关系到SeNPs的抗菌能力，但目前报道的大多合成方式仅限于实验室小批量生产，真正应用还需综合考虑绿色环保、简单便捷、成本低廉等因素，探索大批量绿色合成SeNPs的工艺将是未来研究的重要方向。

2 SeNPs抗菌机制

目前，关于SeNPs抗菌机制的研究仍在进行中，现有的研究主要包括三种理论。

2.1 SeNPs可以诱导细菌产生大量活性氧(ROS) 研究[20]认为，SeNPs能诱导细菌生成大量ROS，破坏细菌内的氧化还原平衡机制，使细菌发生氧化损伤，从而破坏氧化膜脂质、蛋白质和DNA结构。其机制可能为SeNPs缓慢释放进入细胞内，诱导加速产生ROS[21]的同时也可以直接与蛋白质和核酸的氨基、巯基和羧基官能团相互作用，产生蛋白质凝固等毒性效应[22-23]。Zonaro等[16]发现在细菌生物膜和细菌悬液中，SeNPs诱导产生的ROS量均高于加入亚硒酸盐组，随着ROS产生量的增加，SeNPs对细菌的毒性逐渐增加。

2.2 SeNPs能破坏细菌细胞膜的完整性 革兰阳性菌的细胞壁主要由一层厚而致密的肽聚糖层组成，肽聚糖是多个分子交联形成的碳水化合物聚合物。革兰阴性菌的细胞壁则主要由较薄的肽聚糖层与脂多糖组成，脂多糖形成其外膜。这些成分使细菌细胞壁上带负电荷，与带正电荷的SeNPs产生静电作用，从而损伤细菌细胞壁[24]；SeNPs诱导产生的ROS也可以引起脂质过度氧化，破坏细胞膜的结构，增加细胞质膜的通透性，引起细胞裂解、质壁分离[25]。电镜观察发现，改良SeNPs材料能使细菌细胞壁出现明显的损伤和凹陷现象，引起质壁分离和内容物流出[26]，酶标仪定量分析的结果也显示改良SeNPs材料可以对细菌细胞膜和细胞质膜造成极大的损伤，从而发挥抗菌效能。Liu等[25]定量测定改良SeNPs材料抑制细胞膜组成原件的基因表达的能力，检测大肠埃希菌的细胞膜基因表达情况发现，SeNPs处理组中孔道蛋白基因OmpA与OmpF的表达均下调，表明SeNPs可能会破坏细胞膜的稳定性与通透性、损伤细菌泵出抗菌剂的能力。随SeNPs浓度增加，黏附相关蛋白基因CsgA、CsgG的表达逐渐减少，表明SeNPs可以降低大肠埃希菌的黏附性。

2.3 SeNPs能破坏DNA结构 SeNPs破坏细菌膜系统后，可以渗透到细胞中，与DNA、蛋白质发生不可逆的结合，使DNA浓缩而丧失复制能力[27]，同时产生过量ROS引起细菌的氧化损伤，破坏大量蛋白质和DNA结构[23]，引起细菌生长滞后、最大生长速率显著降低、细菌菌落减小。Beheshti等[28]研究SeNPs对细菌DNA的损伤作用，发现从SeNPs处理组中可以分离出DNA片段，其大小在100至1 000个碱基对之间，而对照组无明显的DNA片段。研究[29]发现，随着SeNPs材料浓度增加，大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的DNA与RNA表达水平逐渐下降。

3 改良SeNPs材料的研究进展

为进一步提高SeNPs的抗菌活性，有学者将SeNPs与其他抗菌材料耦合以达到协同抗菌作用，也有学者通过应用修饰剂提高SeNPs的生物活性和靶向性。有研究[30]将 Se与Ag耦合，合成一种双金属纳米粒子(Ag-SeNPs)，同时用槲皮素(QC)和没食子酸对Ag-SeNPs包覆以稳定纳米颗粒性质和增强抑菌效果，形成Qu-Gallic Acid@Ag-SeNPs并比较不同材料对革兰阴性大肠埃希菌和革兰阳性枯草芽孢杆菌的抑菌效果，发现Qu-Gallic Acid@Ag-SeNPs抑菌作用与氯霉素相当，优于硝酸银和亚硒酸钠的协同作用。Prateeksha等[31]将蜂蜜中的多酚化合物与SeNPs耦合，设计合成一种大小为12.4 nm HP-SeNPs。体内试验和体外试验均表明，HP-SeNPs抑制铜绿假单胞菌的能力均强于多酚化合物和SeNPs。4.5 μg/mL的 SeNPs@HP对细菌的生物膜抑制率超过90%，对铜绿假单胞菌的毒力因子蛋白酶、弹性蛋白酶、铜绿假单胞菌素和鼠李糖脂的抑制率分别为60.2%、52.7%、49.6%和59.6%。Yang等[29]用槲皮素对CdSe进行修饰，并覆以ZnS合成了QCZ-NPs，此颗粒不仅能抑制多种耐药菌的生长，还具有较强的抗炎能力，给感染枯草芽孢杆菌的小鼠静脉注射QCZ-NPs后，其组织中炎症与坏死区域显著减少。Huang等[26]将槲皮素和乙酰胆碱(Ach)修饰在SeNPs的表面，结合槲皮素的抗菌活性和乙酰胆碱靶向细菌细胞膜的能力，合成了一种新型的对抗多重耐药菌的抗菌剂(Qu-Ach@SeNPs)，在试验中发现，当作用60 min时，25.0 μg/mL的Qu-Ach@SeNPs能杀灭91.7%的大肠埃希菌和 92.3%的金黄色葡萄球菌。将Qu-Ach@SeNPs 和多药耐药大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌共培养30 代之后，Qu-Ach@SeNPs的MIC值并无明显变化，说明细菌难对Qu-Ach@SeNPs产生耐药性。改良SeNPs材料是未来抗菌材料中不可或缺的一部分。

4 临床应用与展望

已有学者提出将SeNPs应用于医疗器械的抗菌涂层，以防止细菌定植和生物膜形成[32]。研究[33]发现，由于聚合物表面性能的差异，不同SeNPs涂层的抗菌活性区别较大，其中，SeNPs聚氯乙烯涂层抑菌作用最佳，优于市售的Ag聚氯乙烯涂层。有研究将SeNPs应用于骨组织工程领域，把SeNPs固定于球性PLGA颗粒中，并将这些粒子包覆在生物活性玻璃支架上，结果表明，该材料对革兰阳性菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(骨科感染的主要病原体之一)的抗菌活性显著[34]。TiO2纳米管是临床中整形外科与牙科常用的植入物，但其表面极易受到细菌污染。为提高其利用价值，将SeNPs掺入TiO2中合成了TNT-Se，结果发现，与对照组相比，TNT-Se上大肠埃希菌的密度降低了94.6%，金黄色葡萄球菌的密度降低了89.6%[25]。进一步比较含不同密度SeNPs的TNT-Se抗菌效能，仅作用4 h，低密度组TNT-Se上的大肠埃希菌减少了60%，而高密度组则减少了90%[35]。不难得出，SeNPs在医疗设备中有较大应用潜力。

SeNPs的抗菌特性在伤口敷料中也有较大应用价值。将SeNPs原位沉积于壳聚糖支架中合成伤口敷料材料(CS-Se)，CS-Se对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均具有较强的抗菌活性[36]。同时，相较于CS-Ag、CS-Se对小鼠成纤维细胞的毒性显著降低。Ramya等[37]对比SeNPs和庆大霉素对大鼠伤口愈合的影响，分别设置未处理组、标准抗生素组、SeNPs低浓度组和SeNPs高浓度组，结果显示，SeNPs低浓度组和SeNPs高浓度组分别于第21天和第18天治愈了大鼠的伤口，而标准抗生素组和未处理组分别用了21、30 d。

可见，SeNPs有望应用于伤口愈合治疗中。

5 总结

目前，越来越多的研究聚焦于SeNPs的抗菌能力，并逐渐证实其在抗菌方面的应用价值。但其抗菌的机制仍待进一步研究和完善，也有一些问题亟待解决：(1)SeNPs的毒性具有剂量依赖性，其体内代谢过程仍未清楚，其临床应用的安全性仍待进一步研究。(2)不同结晶度的SeNPs生物活性不同，需要对晶体态和非晶态SeNPs的生物活性进行更系统的研究，以充分区分大小、形状等对其活性的影响。(3)目前关于SeNPs抗感染活性的研究还主要集中在细胞研究阶段，部分学者对其临床应用提出质疑，有必要在动物模型中进行更深入的临床前研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。