藏药十五味萝蒂明目片的质量标准提高*

郭静 刘红 张学花 邢会香 曹得辉 石慧慧

(青海普兰特药业有限公司，青海 西宁 810007)

十五味萝蒂明目片是传统藏药复方制剂，由萝蒂、寒水石(奶制)、藏茴香、石灰华、甘草、红花、渣驯膏、丁香、金钱白花蛇、绿绒蒿、铁屑、诃子、余甘子(去核)、代赭石、毛诃子组成[1]。原标准[1]含量检测指标单一，只检测了萝蒂(阿魏酸)含量。已有相关文献报道以甘草酸、甘草苷作为指标性性成分进行含量测定[2-3]，在查看大量处方相关含量检测文献[4-12]并经实验分析后，采用HPLC法测定甘草中甘草酸含量；矿物药中存在重金属与砷较多，该处方中含多味矿物药材(代赭石主含三氧化二铁，铁屑主含铁，石灰华主含碳酸钙[13]，寒水石主含硫酸盐[14])。由于重金属及砷含量严重影响药品质量，结合前期相关文献报道[16-18]及2020年版《中国药典》含类似矿物品种重金属、砷盐检查方法分析[19-22]，制定出该制剂中重金属、砷盐检查方法，为有效控制该制剂的质量提供实验依据。

1 材料

1.1仪器 ACQUITY Arc高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司)、LC-15C高效液相色谱仪(岛津有限公司)；ML204T/02万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；C3860超声波清洗仪(深圳市洁盟清洗设备有限公司有限公司)；SX-4-10箱式电阻炉(天津泰斯态仪器有限公司)；HH-S11.4电热恒温水浴锅(江苏金怡仪器有限公司)；ACE Excel 5 C18色谱柱(广州菲罗门科学仪器有限公司)；万用电炉。

1.2药材与试剂 砷标准溶液、铅标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号分别为：GSB-04-1714-2004、GSB-04-1742-2004)；甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110731-201720，纯度：97.7%)，甲醇、乙腈均为进口色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水；十五味萝蒂明目片、缺甘草阴性均由青海普兰特药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1重金属检查

2.1.1对照溶液的制备 称取硝酸铅0.1599 g，置1000 mL量瓶中，加硝酸5 mL与水50 mL溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备溶液。临用前，精密量取贮备液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得标准铅溶液(每1 mL相当于10 μg的Pb)。取一支25 mL纳氏比色管，加标准铅溶液3 mL与醋酸盐缓冲溶液(pH3.5)2 mL后加水稀释成25 mL，记作甲管。

2.1.2供试品溶液的制备 取本品1 g，精密称定，置铂坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸1 mL使湿润，加热至硫酸蒸汽除尽后，加硝酸0.5 mL，蒸干，至氧化氮蒸汽除尽后，在500～600 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加7 mol·L-1盐酸溶液10 mL，搅拌5 min，滤过，滤渣用7 mol·L-1盐酸溶液洗涤3次，每次5 mL，合并滤液，置分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次20 mL振摇10次，弃去乙醚液，酸液置水浴上蒸干，加水15 mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微红色，再加醋酸盐缓冲溶液(pH3.5)2 mL，微热溶解后，加20%盐酸羟胺溶液2 mL，滤过，滤液置25 mL纳氏比色管中，滤渣用水洗涤，合并洗涤液，加水稀释至刻度作为供试品溶液，记作乙管。

2.1.3检测溶液的制备 分别加入与乙管相同质量的供试品和与甲管相同质量的标准铅溶液，照2.1.2法制成测试溶液，记作丙管。

2.1.4空白对照溶液 照2.1.2方法不加样品制成空白对照溶液。

2.1.5比色结果 将上述三支25 mL纳氏比色管及空白对照溶液同置白纸上，自上向下透视，结果显示丙管(D)中显出的颜色深于甲管，故乙管与甲管比较，乙管(C)中显出的颜色浅于甲管(B)，即样品中重金属含量少于百万分之三十，见图1。

A.空白溶液；B.对照溶液；C.供试品溶液；D.检测溶液

2.2砷盐检查

2.2.1标准砷对照液的制备 精密量取标准砷溶液2 mL，置A瓶中，加盐酸5 mL与水21 mL，再加碘化钾试液5 mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10 min后，加锌粒2 g，立即将导气管C与A瓶密塞，使生成的砷化氢气体导入D管中，并将A瓶置25～40℃水浴中反应45 min，取出D管，添加三氯甲烷至刻度，混匀，即得。仪器装置，见图2。

图2 砷装置图

2.2.2供试品溶液的制备 取本品0.67 g，精密称定，置铂坩埚中，加氢氧化钙1.0 g,混匀，加水2～4 mL，搅匀，缓缓炽灼至完全炭化，在500～600 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加水5 mL，再缓缓加盐酸4 mL(注意泡沸)，搅拌5 min，滤过，加水15 mL洗涤滤渣，合并滤液，再加盐酸4 mL，照2.2.1检查法，自“再加碘化钾试液5 mL”起，至添加三氯甲烷至刻度，混匀，即得。

2.2.3比色结果 将所得溶液与标准砷对照液同置白色背景上，从D管上方向下观察、比较，结果显示供试品溶液的颜色较标准砷对照液的颜色浅，即样品中砷盐含量少于百万分之三，见图3。

A：砷对照液；B、C：供试品溶液

2.3甘草酸的含量测定

2.3.1色谱条件[23]色谱柱：ACE Excel 5 C18(250×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈-3.3%冰醋酸溶液(33∶67)；检测波：252 nm；柱温：28 ℃。理论板数按甘草酸峰计应不低于5000。

2.3.2甘草酸对照品溶液的制备 取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。

2.3.3供试品溶液的制备 取十五味萝蒂明目片适量，研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，超声处理(功率480 w，频率40 kHz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4阴性样品溶液的制备 按十五味萝蒂明目片处方，除甘草外按比例称取其余药材，根据制备工艺，制成阴性样品，按2.3.3项下供试品溶液制备的方法制成阴性对照溶液。

2.3.5空白溶液的制备 稀乙醇溶液

2.3.6专属性试验 精密量取甘草酸对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液、空白溶液各10 μL，按2.3.1项下色谱条件进行测定，记录色谱，见图4。结果显示空白溶液、阴性样品溶液对主色谱峰无干扰，对照品和供试品溶液中主色谱峰保留时间一致。另采用PDA检测器对对照品溶液、供试品溶液中的主色谱峰进行峰光谱扫描和纯度检测。结果显示对照品和供试品溶液中主色谱峰纯度角度小于纯度阈值，纯度符合要求，具体数据见表1，本试验提示该方法专属性良好。

A.供试品溶液；B.阴性样品溶液；C.甘草酸对照品溶液；D.空白溶液

表1 样品和对照品主色谱峰纯度角度和纯度阈值列表

2.3.7线性关系考察 精密称取甘草酸铵对照品21.36 mg，加70%乙醇制成0.209 mg·mL-1的对照品贮备溶液。分别精密移取2、3、5、7 mL置25 mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀得标准系列浓度的测试溶液。分别精密吸取各系列浓度的对照品溶液10 μL按2.3.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。以质量浓度(X,mg·mL-1)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性拟合，得回归方程Y=9E+06X-225.22(r=0.9999)。结果表明，甘草酸在0.0164～0.205 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.8重复性试验 由实验员(甲)照2.3.3方法平行制备6份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定进行测定，记录色谱。结果十五味萝蒂明目片甘草酸含量的RSD为1.5%，在样品中待测成分含量为0.1%时RSD<3(%)，提示该方法重复性良好。

2.3.9中间精密度试验 由另外一名实验员(乙)照2.3.3方法平行制备6份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件用另一台(HPLC-15C)高液相色谱仪进行测定，记录色谱。结果甲乙两名实验员在不同仪器、不同日期、不同色谱柱、不同厂家试剂上测得甘草酸含量的RSD为2.2%，提示该方法中间精密度良好，具体数据见表2。

表2 中间精密度试验结果(n=9)

2.3.10加样回收率试验 精密称取已知含量的十五味萝蒂明目片样品(批号190510)，研细，平行9份样品，分为3组，分别加入3个质量分数水平(50%、100%和150%)的甘草酸铵对照品。按“2.3.3”项下方法制备回收供试品溶液，按“2.3.1”项下方法进样测定，并计算甘草酸的加样回收率，提示该方法的准确度较好，结果见表3。

表3 回收率试验结果(n=9)

2.3.11稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品溶液适量，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算含量。结果表明供试品在稀乙醇溶液中24 h内稳定性良好，具体数据见表4。

表4 稳定性试验结果

3 讨论

在重金属检查中，由于制剂中矿物药种类较多，应先用强酸进行有机破坏。其次考虑供试品在高铁盐情况下，用乙醚萃取的方式去除铁屑和代赭石的颜色干扰，再用20%盐酸羟胺酸性液将3价Fe还原为2价，消除氧化硫化氢产生的白色浑浊。

在砷盐检查中，由于有机物对砷盐可能存在吸附、络合等作用影响检出，在选用氢氧化钙法做有机破坏时，经有机破坏与未经有机破坏的试验进行对比，发现经有机破坏的样品能有效排除铁粉和代赭石颜色干扰。

在甘草酸含量测定中，发现样品流动相pH在2.0时对色谱柱的选择性较高。ACE色谱柱较一般C18色谱柱分离效果好，耐用性好，故在偏酸环境中推荐选择ACE色谱柱。

综上所述，十五味萝蒂明目片含量测定、重金属、砷盐检查方法操作简单，重复性、准确度及耐用性良好，本研究为今后该品种质量标准的提高奠定了良好的基础。