Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞牙/骨向分化的影响

蒋 玫，张悦蓉，沈天晖，张光东

根尖周炎是由龋病或外伤等多种因素引起的一种常见口腔疾病[1]，大多是牙髓微生物感染导致根尖周组织炎症及骨破坏[2]。根管治疗术是治疗牙髓或根尖周疾病的最佳方案[3]。但是，当年轻恒牙发生根尖周炎时，牙根无法正常发育，导致根尖孔敞开，降低患牙的存留率[4-5]。因此，治疗年轻恒牙的重点应是控制感染和形成根尖封闭。

以干细胞为基础的再生治疗使得年轻根尖周病变患牙根尖愈合成为可能。目前，年轻恒牙根尖周病变最常用的治疗方法是用氢氧化钙糊剂或三氧化矿物聚集物(mineral trioxide aggregate, MTA)结合根尖屏障术或根尖诱导成形术来控制感染，实现根尖闭合[4-5]。来自年轻恒牙的根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, SCAPs)是一种牙源性间充质干细胞，具有自我更新能力、高增殖潜能和低免疫原性[6]。大量证据表明，SCAPs能够分化为多种细胞系，如成骨细胞、成牙本质细胞、软骨细胞和肝细胞等，有望成为一种干细胞治疗来源[7-8]。研究表明，SCAPs可从长期暴露于炎症环境的年轻恒牙中分离出来，但其增殖能力和牙/骨向分化潜能均低于健康的牙乳头细胞[9]。

Tideglusib是目前主要用于治疗阿尔茨海默病的药物，它为糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的一种不可逆、非ATP竞争的抑制剂[10-13]。GSK-3β的一个重要作用是在体内调节干细胞[14]。作为炎症反应的主要调节因子，GSK-3β通过激活Toll样受体从而刺激促炎细胞因子包括IL-6、IL-8、TNF-α等的产生[15]，而此类细胞因子刺激与根尖周炎症相关的骨吸收[16]。有研究表明，GSK-3β作为破骨细胞分化的负调控因子，在破骨细胞形成过程中发挥着重要作用[17-18]。Sun等[19]证实，GSK-3β表达增强和GSK-3β激酶活性增加在根尖周疾病的发生发展中很重要，推测GSK-3β抑制剂对根尖周疾病有治疗作用。近年来，英国学者Sharper教授团队发现治疗用于治疗阿尔茨海默病的Tideglusib成功诱导小鼠自然修复牙本质形成，在小鼠和大鼠磨牙髓腔中产生的修复性牙本质完全修复了病变缺损，其矿物质含量和组成与正常牙本质相似[20-21]，但其机制还有待进一步研究。

本研究拟通过细胞培养、流式细胞术、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)及Western blot等实验方法，研究Tideglusib对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的SCAPs牙/骨向分化能力的影响，为年轻恒牙根尖周炎的治疗提供参考及新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Tideglusib(MCE, hy14872，美国)，LPS(Sigma,L2630，美国)，基本培养液 α-MEM(Gibco，美国)，胎牛血清(Gibco,美国)，磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone，美国)，双抗(Gibco,美国)，胰蛋白酶(Gibco,美国)，Ⅰ型胶原酶(Sigma,美国)，SDS-PAGE 凝胶试剂盒(碧云天，中国)，蛋白Marker(Fermentas,美国)，抗核心结合蛋白因子-2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)抗体、抗牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)抗体、抗成骨细胞特异性转录因子(osterix，OSX)抗体、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)抗体、抗Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen，COL-Ⅰ)抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(Abcam，美国)，CCK-8 试剂盒(Dojindo，日本)，碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天，中国)，碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成公司，中国)，RNA 提取试剂盒(Bioteke，中国)，酶标仪ELx800(BioTek instruments sinc,美国)，微孔板分光光度计(MD,美国)，化学发光凝胶成像系(GE,美国)，流式细胞仪(BD,美国)，ABI 7500real-time PCR system(ABI，美国)等。

1.2 实验方法

1.2.1 SCAPs原代培养 于2019年12月—2021年6月选取本院口腔颌面外科14～22岁无龋、无牙周炎患者的因阻生或正畸原因拔除的磨牙或前磨牙(南京医科大学附属江苏省口腔医院伦理审核编号-PJ2020-116-001)。用含有1%双抗的PBS冲洗2次，然后用手术剪在超净台中取下根尖牙乳头，在α-MEM中剪碎组织，加入500 μL 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和200 μL 4 mg/mL胰酶，在37 ℃及5% CO2条件下孵育消化20 min。加入完全培养基即含有10% FBS的α-MEM 培养液终止消化。带组织块的单细胞悬液在1 000 r/min下离心5 min后，弃上清，重悬于完全培养液中后接种于培养皿中，于37 ℃及5% CO2孵箱中培养细胞，每3～4 d换液。当细胞达到80%融合时，胰蛋白酶消化传代。本研究采用生长状况优良的2代SCAPs。

1.2.2 SCAPs的表面分子鉴定 使用流式细胞仪鉴定SCAPs表面抗原。将SCAPs常规进行胰酶消化，经过离心重悬后，稀释细胞，后置于EP管内。各管中分别加入荧光标记抗体CD29、CD73、CD105、CD34、CD45，空白对照组仅有细胞悬浊液，4 ℃条件下避光孵育1 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS 洗，于200 μL PBS中重悬，使用流式细胞仪检测。

1.2.3 CCK-8实验 以2 000个细胞/孔的密度在96孔板中铺细胞。用CCK-8试剂检测Tideglusib对细胞增殖是否有影响。Tideglusib的浓度梯度为0、10、50、100、200 nmol/L，每个浓度梯度设置5个复孔。应用CCK-8试剂于第0、1、3、5、7、9天，37 ℃孵育2 h、450 nm波长下测定吸光度值。

1.2.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性测定 将SCAPs置于由完全培养基、50 mg/L β-甘油酸磷酸钠、10 nmol/L磷酸抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松组成的成骨诱导培养基中培养，每2～3 d换液，直至第7天。多聚甲醛固定30 min，用ALP染色试剂盒在37 ℃下染色5～30 min，扫描仪下拍摄及显微镜观察细胞形态。同样，成骨诱导7 d后，用含1%蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液裂解SCAPs，根据ALP检测试剂盒检测细胞ALP活性。用酶标仪在520 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 RT-qPCR 实验分为空白对照组、加LPS组、加入LPS和Tideglusib三组。细胞培养7 d后，根据说明书用RNA提取试剂盒提取各组总RNA。然后使用PCR仪进行检测。引物序列见表1。选择GAPDH作为内参基因，将靶基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)的相对数量标准化，采用“ΔΔCt”法计算数据。

表1 本部分实验所用引物序列

1.2.6 Western blot SCAPs用含Tideglusib的成骨诱导液培养7 d后，用1%PMSF的RIPA裂解细胞，超声振荡后，12 000 r/min 4 ℃下离心裂解后的细胞15 min，提取总蛋白。配制10%分离胶、4%浓缩胶和电泳缓冲液。每个泳道加入10～15 μL蛋白后，调试60 V恒压电泳用于浓缩胶，90 V恒压电泳用于分离胶。转膜前用甲醇浸泡PVDF膜30 s，使其活化，将活化的膜对齐覆盖在胶上一起放入电转仪，以300 mA恒流电转(电转时间根据蛋白指标分子量而确定，平均1分子量电转1 min)。含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液用于封闭膜，在摇床上缓慢振摇2 h后，将膜封入1∶1 000稀释好的一抗，4 ℃过夜。次日，将 PVDF 膜放入配制好的二抗(8 mL TBST中加入山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗各1 μL)，室温下孵育1 h。最后，采用Western blot成像系统对膜进行成像，用Image J软件对条带进行定量分析。

1.3 统计学方法

所有实验重复3次。采用GraphPad Prism 8统计软件进行统计分析，不同组间的差异使用单因素方差分析或Studentt检验。对于两组以上的比较,使用Tukey′s或Dunnett′s事后检验的单因素方差分析(ANOVA)。统计学显著性水平设为α=0.05。

2 结 果

2.1 SCAPs的分离与培养

取年轻恒牙根尖牙乳头(图1A)，酶消化法提取原代细胞，培养约3 d后观察到贴壁细胞，呈长梭形排列(图1B)。

A：年轻恒牙根尖牙乳头；B：SCAPs原代细胞

2.2 SCAPs的鉴定

流式细胞术结果显示，SCAPs间充质干细胞标记物CD29、CD73、CD105表达阳性(阳性细胞比率分别为94.5%、81.5%、54.5%)，而造血干细胞标记物CD34、CD45表达阴性(阳性细胞比率 CD45为9.74%，CD34为16.8%)(图2)。成功提取SCAPs。

图2 SCAPs表面抗原鉴定结果

2.3 CCK-8检测细胞增殖

Tideglusib分子式如下(图3A)。CCK-8结果显示，当Tideglusib的浓度低于50 nmol/L时对SCAPs细胞增殖无明显抑制(图3B)。

A：Tideglusib分子式；B：CCK-8检测结果，与0 nmol/L组比较，**：P<0.05，***：P<0.01，****：P<0.001

2.4 筛选Tideglusib的最佳浓度

调整浓度梯度后，将SCAPs与10 μg/mL LPS 共培养，通过ALP染色(图4A)和ALP活性(图4B)实验证明，仅加入10 μg/mL LPS SCAPs组相较于空白对照组ALP表达明显降低，并筛选出在10 μg/mL LPS 条件下Tideglusib促进SCAPs ALP表达的最佳浓度为1 nmol/L。

A：ALP染色结果(比例尺=200 μm)；B：ALP活性检测结果,****：P<0.001

2.5 Tideglusib对炎症环境下SCAPs牙/骨向分化相关蛋白表达的影响

在成骨诱导培养基中培养SCAPs。细胞培养7 d后，Western blot检测各组细胞中与成牙本质分化和成骨分化相关的蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)的表达。结果显示，LPS组的成牙/成骨相关蛋白表达下降，与LPS组相比，Tideglusib组相关蛋白表达升高(图5)。

A：Western blot 结果，GAPDH 作为内参；B：ImageJ 分析目的条带，**：P<0.05，***：P<0.01，****：P<0.001

2.6 Tideglusib对炎症环境下SCAPs牙/骨向分化相关基因表达的影响

在成骨诱导培养基中培养SCAPs。细胞培养7 d后，RT-qPCR检测各组细胞中与成牙本质分化和成骨分化相关的基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)的表达。结果显示，LPS组的成牙/成骨相关基因表达下降，与LPS组相比，Tideglusib组相关基因表达升高(图6)。

**：P<0.05,***：P<0.01,****：P<0.001

3 讨 论

当代口腔医学认为，组织再生(包括控制感染和诱导根尖持续生长)对年轻恒牙根尖周炎症的预后优于根尖手术和传统的根管治疗[22]。发生根尖周炎的年轻恒牙常由于非生理性冠根比(crown-to-root ratio, CRR)，存在远期的术后并发症，如根折或牙齿松动。因此，本研究希望探索出一种能够促进炎性根尖周组织再生的药物，使年轻恒牙发生根尖周炎时，其牙根还能继续发育。

LPS为革兰氏阴性菌外膜的主要成分[23]，是一种强效的毒力因子，在成牙本质细胞、成纤维细胞和牙髓细胞中引起多种免疫反应。研究表明，革兰氏阴性菌是坏死牙髓中最常见的微生物[24]，而LPS诱导的细胞因子和趋化因子持续存在于牙髓及SCAPs中，参与免疫反应和组织降解[25]。此外，在其他牙源性干细胞如牙髓干细胞和牙周膜干细胞中，也报道了LPS刺激导致成骨相关基因表达及细胞增殖的改变[25-27]。LPS被认为与牙根的发育相关，来源于大肠杆菌而不是牙龈卟啉单胞菌的LPS诱导细胞因子和趋化因子的表达[28]。Huang等[29-30]研究表明，LPS可用于牙周膜干细胞，用以模拟体外炎症环境。因此，本研究选取大肠杆菌LPS进行后续实验。LPS对牙源性干细胞的细胞增殖和成骨分化的影响显示为增强、抑制或不影响取决于干细胞和LPS的来源以及LPS的浓度[31-32]。有报道称，1 μg/mL的LPS可以保护间充质干细胞，防止细胞凋亡并促进细胞增殖，而高剂量的LPS则会在体外增加间充质干细胞的凋亡[33]。以往文献利用10 μg/mL的LPS，通过测定成骨相关指标及炎性因子等的表达，构建牙周膜干细胞及牙髓干细胞的体外炎症模型[34-35]。因此，本实验选取的LPS浓度为10 μg/mL，LPS刺激SCAPs 1周后，通过ALP染色、ALP活性、Western blot和RT-qPCR实验证实了细胞ALP表达及牙/骨向分化相关基因和蛋白(OSX/OSX、OCN/OCN、COL-Ⅰ/COL-Ⅰ、DSPP/DSP、RUNX2/RUNX2)的表达下降，矿化能力降低，与以往的研究结果一致。

近年来，相关研究成功应用GSK-3拮抗剂促进牙本质再生，它通过激活牙髓干细胞来刺激修复性牙本质的自然形成。Tideglusib是FDA批准的GSK-3β抑制剂,因促成牙/成骨作用而在口腔医学领域受到关注[20-21,36]。Marianne等首次证明Tideglusib通过抑制GSK-3β促进成骨分化[37]。也有研究表明Tideglusib能够以凝胶形式通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙髓干细胞的成牙本质向分化[36]。Wnt/β-catenin信号通路在成骨分化中起重要作用[37]。而目前尚未有Tideglusib对炎性根尖周组织是否存在促进牙/骨向分化作用的相关研究。

ALP在羟基磷灰石晶体的形成中起重要作用，羟基磷灰石晶体在成骨细胞和成牙本质细胞矿化初期不可或缺，其活性在早期钙化过程中上调[38]。因此，ALP在许多研究中被用作牙/骨向分化的早期标记物[39-40]。本实验通过检测细胞在第7天的ALP活性结果显示，Tideglusib促进LPS刺激SCAPs分化的最佳浓度为1 nmol/L。CCK-8实验也表明，1 nmol/L的浓度不影响SCAPs细胞增殖。然而，有关Tideglusib在根尖周组织细胞的相关研究较少，其在不同条件下的最佳用药浓度选择仍需进一步探究。我们通过选择不同阶段牙/骨向分化的重要调控基因和蛋白(OSX/OSX、OCN/OCN、COL-Ⅰ/COL-Ⅰ、DSPP/DSP、RUNX2/RUNX2)[41-43]作为研究指标，发现Tideglusib对促进LPS刺激的SCAPs矿化的作用显著，这是否是因为Tideglusib激活Wnt/β-catenin信号通路或有其他矿化相关信号通路参与作用，仍需要进一步的研究证实。

已有学者研究出一种胶原蛋白海绵，可供低剂量的小分子GSK-3拮抗剂附着，促进牙本质的自然恢复[20]。作为载体的海绵随着时间的推移逐渐降解，牙本质占据海绵的空间，取代其实现了完整有效的自然修复。这为我们后续如何Tideglusib将应用于临床提供了思路。

本研究初步证实了Tideglusib对于LPS刺激的SCAPs有促进其成牙/成骨向分化的作用，为年轻恒牙根尖周炎的治疗提供了新的思路。而Tideglusib的具体作用机制，以及其成牙/成骨向分化与抗炎作用是否有相关性还需要进一步探究。