超高效液相色谱-串联质谱法测定水中8种微囊藻毒素

张盼伟，郎 杭，丁相毅，赵晓辉，李 昆，万晓红，李 争

(中国水利水电科学研究院，北京 100038)

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)为七肽单环肝脏毒素，由于其分子结构存在着环状结构和间隔双键，所以MCs具有非常高的稳定性[1]，在发生水华的自然水体中能保持几天不降解[2]；同时还具有较高的水溶性和耐热性，易溶于甲醇、可溶于水，即使加热到100℃其结构也不会被破坏。随着检测仪器及分析技术不断进步，目前已经发现的MCs异构体近百种[3-4]，在已经发现的MCs异构体中，最常见且已商业化提取的有MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY，其中L、R、Y、F、W分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸[5-6]。20世纪90年代后期，中国淡水水体富营养化日益严重，范围不断扩大，在大型湖泊、水库、河流水华暴发时，蓝藻中的MCs在其凋亡后会大量释放，使水环境中藻毒素达到较高浓度水平，有可能造成潜在的生态风险[7]，根据相关研究报道，淡水中MCs含量通常为0.1～1.0 μg/L，但是当蓝藻水华暴发后，凋亡后的蓝藻大量腐败消解会产生大量的MCs，其含量最大可达80～90 μg/L[8]，远超GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》中规定的MC-LR的标准限值(1.0 μg/L)。

目前检测水中微囊藻毒素的主要技术方法有生物法[7]、分子技术法[10]和仪器分析法[11-13]等，其中尤以仪器分析方法较为常用。常用的仪器分析方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法和高效液相色谱-质谱联用法。其中高效液相色谱法采用保留时间定性、峰面积定量，其容易受到样品基质干扰，进而影响化合物的定性与定量的准确性；而质谱通常是通过离子定性与定量，准确度相较于液相色谱具有非常大的提高，抗干扰能力强；其中使用液相色谱-质谱联用技术的仪器分析法在MCs检测中使用最广，该技术具有灵敏度高和选择性好的优势，对于基质复杂的样品具有很好的筛选性能，且串联质谱比单级质谱的检测灵敏度更高[14-16]。研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术对水中8种MCs进行检测分析，选取母离子及子离子组成离子对进行定性、定量分析。本方法相较于已经报道的高效液相色谱法与质谱法[6,12,17-19]，具有检测MCs种类多、样品前处理简单、准确度高和精密度好的优点，且极大降低了检出限和定量限，检出限相较于中国MCs相关检测标准低20～30倍；该方法能够在10 min内对8种微囊藻毒素进行准确快速检测，可为相关主管部门快速判别水体中痕量微囊藻毒素的污染状况、主要优势异构体的判别提供方法保障，还可为中国湖库型水源地蓝藻“暴发”期的快速监测与预警提供技术支持。

1 试验部分

1.1 试剂与材料

8种MCs样品分别为MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY(均购自Dr.Ehrenstorfer公司，德国)。试验中所用甲醇、乙腈均为色谱纯(J.T.Baker，Phillispsburg，美国)；甲酸(色谱纯，Dikma 公司)；试验用水均为纯水(经MilliQ系统纯化，电阻率为18.3 MΩ·cm)；玻璃纤维滤膜(47 mm×0.45 μm，Whatman 公司，英国)；针式滤膜(13 mm×0.22 μm，CNW公司，德国)；HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg，Waters公司，美国)，C18固相萃取柱(6 mL/500 mg，Waters公司，美国)；氮气(纯度大于等于99.999%)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290型超高效液相色谱仪，配有Agilent 6460质谱检测器(ESI源)；Hei-VAP旋转浓缩仪，德国；N-EVAP-12型氮吹仪，美国；固相萃取仪，Waters公司，美国。

1.3 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD(2.1×100 mm，1.8 μm)；柱温40℃；自动进样，进样量为10 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～2 min、30% B，2～7 min、30%～60% B，7～10 min、60%～30% B。

1.4 质谱条件

电喷雾正离子模式，多反应监测(Multiple Response Monitoring，MRM)，雾化器压力为310 kPa(45 psi)，毛细管电压3 500 V，干燥器温度325℃，氮气流速为11 L/min。母离子、子离子及相关参数见表1。

1.5 样品前处理

将固相萃取柱连接在固相萃取装置上，依次使用10 mL甲醇、10 mL纯水进行活化。准确量取500 mL水样品，使用0.45 μm玻璃纤维滤膜对量取的水样进行过滤，将过滤后的水样使用已活化好的固相萃取柱进行富集，样品流速控制在8～10 mL/min。富集完成后，用10 mL 20%的甲醇溶液淋洗，每次5 mL，弃去淋洗液。用缓和氮气吹扫固相萃取柱，以去除残留在固相萃取柱中的水分，再用10 mL甲醇溶液洗脱固相萃取柱，每次5 mL，收集洗脱液至K-D浓缩瓶中，将洗脱液在氮吹仪上用缓和氮气浓缩至近干，用30%甲醇水溶液定容至1 mL，混匀后用0.22 μm滤膜过滤，过滤液置于2 mL棕色进样瓶中，待测。

表1 8种MCs母离子、子离子及相关参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

使用自动进样器直接进样，对碎裂电压及碰撞能量等因素进行优化，确定8种MCs质谱图中响应最高的离子作为母离子。8种MCs中，MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-WR结构中均有精氨酸，每个精氨酸中均有1个胍基。胍基容易带1个正电荷，进而决定了整个分子电离后容易形成[M+H]+母离子；但是MC-RR与其他几种不同，其每个分子中具有2个精氨酸，每个精氨酸均带1个正电荷，因此其分子的母离子为[M+2H]2+(m/z为519.8)。MC-LA、MC-LY、MC-LF及MC-LW分子中没有精氨酸，其母离子在Adda基团的甲氧基上带一个正电荷，形成[M+H]+。所有MCs都具有Adda结构，它与各种藻毒素毒性关系密切。在试验中发现，8种MCs母离子裂解的子离子中均有较强的m/z 135的碎片峰，它是由Adda基团甲氧基发生α裂解产生的。m/z 213附近的碎片峰也与Adda的α裂解有关，研究中出现的次数也较高。MC-LA子离子m/z 776为母离子丢掉甲基-苯乙基醚的产物，MC-LY子离子m/z 985可能是母离子失水的结果。在MC-RR分子中，质子数等于精氨酸残基数，所有质子被束缚在氨基酸侧链上，导致分子发生“charge-remote”模式电离，产生m/z 127子离子[20-21]。为增强离子化效率，在使用ESI离子源时，常常需要加入离子化增强剂。试验使用甲酸作为离子化试剂，并对离子化试剂的用量进行优化，不同浓度加酸对灵敏度的影响见图1。从图1可知，将流动相中加入一定体积的甲酸后，大部分MCs的灵敏度均有所提高，在添加浓度为0.1%～0.2%时，8种MCs灵敏度变化不明显。所以试验最终采用在流动相中添加0.1%甲酸以增强各化合物的灵敏度，优化后的总离子流图见图2。

图1 不同甲酸添加浓度对仪器灵敏度的影响

图2 8种MCs色谱

2.2 固相萃取柱的选择

根据MCs的理化性质，一般选用C18或HLB固相萃取柱进行样品的富集和净化。选择2种C18小柱和HLB小柱进行回收率试验，结果见图3，ENVI C18小柱对8种MCs的回收率范围为75%～110%，相对标准偏差为8%～15%；Sep-Pak C18小柱对8种MCs的回收率范围为77%～115%，相对标准偏差为7%～13%；HLB小柱对8种MCs的回收率范围为85%～107%，相对标准偏差为5%～11%。2种小柱对8种MCs的回收率和相对标准偏差基本满足试验要求，但HLB小柱相较于其他2种C18小柱来说，回收率更高，精密度更好，所以试验选取HLB小柱作为固相萃取柱。

图3 不同固相萃取柱对8种MCs的回收率

2.3 方法检出限

推荐配制8种MCs质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L(可根据实际样品浓度进行调整)的混合标准溶液，以目标化合物的响应值y与相应的质量浓度x(μg/L)绘制标准曲线，检出限利用3倍信噪比的方法计算，见表2。由表2可知，在加标浓度为0.1～50.0 μg/L范围内，8种MCs的线性关系良好，定量下限范围为0.006～0.018 μg/L，满足WHO及中国地表水、生活饮用水相关控制标准的要求。

表2 8种MCs的线性范围、相关系数及检出限

2.4 方法准确度与精密度

分别向地表水样品中加入1 μg/L(低浓度)、10 μg/L(中间浓度)、50 μg/L(高浓度)标准溶液，每个浓度添加水平设置5个平行样品，计算回收率及精密度，试验结果见表3。由表3可知，在添加低浓度水平时，8种MCs的回收率范围为85.3%～107.5%，RSD范围为3.6%～11.7%；添加中间浓度水平时，8种MCs的回收率范围为88.9%～103.3%，RSD范围为3.6%～8.5%；添加高浓度水平时，8种MCs的回收率范围为90.3%～105.4%，RSD范围为3.3%～8.5%。

2.5 实际样品的测定

2021年9月，采集华北某地区水库水样，按照上述方法对水样中8种MCs进行检测，结果见表4。由表4检测结果可知，即使不在蓝藻水华高发的7、8月，华北地区水库水体中还是检出藻毒素的存在，一般以MC-LR和MC-RR较为常见，与中国相关标准限值比较，其未出现微囊藻毒素超标情况。

表3 8种MCs回收率及精密度(n=5) %

表4 华北某地区水库实际样品微囊藻毒素测定值 单位：μg/L

3 结论

本研究应用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱对地表水中8种MCs进行分析，建立了一种固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱同时检测地表水中8种MCs的分析方法。本研究对8种MCs主要分子离子峰进行了初步解析，使定性更加准确。该方法线性关系好，准确度高，精密度好，样品前处理简单，检出限能够满足WHO及中国GB 3838—2002《地表水质量标准》中集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值和GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》中水质非常规指标及限值要求。该方法还具有快速和操作简单等特点，可为中国水体中微囊藻毒素的检测提供技术支撑。