基于AAT 与细胞因子构建活动性肺结核的Nomogram 预测模型

樊 浩 ，刘幸 ，沈凌筠 ，李海雯 ，余春红 ，李婧炜

（1）大理大学药学院，云南 大理 671000;2）云南省传染病临床医学中心/昆明市第三人民医院药学部，云南 昆明 650301）

结核病是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，主要累及肺部又称肺结核（pulmonary tuberculosis，PTB）。活动性肺结核是指MTB 经实验室检查证实有活动性依据的结核病，由于排菌肺结核患者携带的MTB 传染性较强，严重威胁人们的生命健康，目前已成为严重的全球性公共卫生问题[1]。据统计2021 年我国新发肺结核人数约86 万，远超新冠肺炎患病人数，仅次于印度，是结核病高负担国家之一[2−3]，有研究发现近年来菌阴肺结核患者显著增加[4]，而国内外诊断肺结核的“金标准”则是在患者的痰培养中发现结核杆菌[5]，菌阴肺结核患者数量增加势必导致痰培养检出率下降。同时还存在痰培养周期长、实验要求较高等限制[6−7]，病原学检查明显不能满足临床需求。但截止目前，临床上尚无高效的生物标志物用于活动性肺结核的判断，因此寻找准确、简便、快捷的实验室诊断方法对活动性肺结核的早期诊治至关重要。

目前针对肺结核早期诊断的研究成为临床研究的热点，有研究表明活动性肺结核患者外周血中的白介素（Interleukin）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、干扰素诱导蛋白（Interferon-inducible protein）等细胞因子都显著升高，当急性期时，机体吞噬细胞水平显著增加[8−9]，其中吞噬细胞分泌的TNF-α 细胞因子能刺激机体局部炎症反应，导致机体触珠蛋白（haptoglobin，HAP）、α1 抗胰蛋白酶（α1 antitrypsin，AAT）、α1 酸性糖蛋白（α1 acid -glycoprotein，AGP）3 者的水平异常升高[10]，因此临床上多考虑其与机体炎症创伤有关，并可用于鉴别急性、亚急性与慢性病理状态，在一定程度上与机体损伤的性质和范围也相关。本研究拟通过检测活动性肺结核外周血中AGP、AAT、HAP及细胞因子水平，探索其在活动性肺结核中的应用价值，并建立简便可靠的Nomogram 预测模型，为活动性肺结核的实验室诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性纳入昆明市第三人民医院2020 年3 月至2021 年3 月收治的活动性肺结核患者96 例。纳入标准：（1）诊断标准均按照：《肺结核诊断标准》（WS288-2017）[11]；（2）实验组患者经影像学检查（包括多发性结节状病灶，片状、云絮状及大叶性肺实变，团块状阴影，以及肺门或纵隔淋巴结增大等）和组织病理学检查（典型病变是肉芽肿伴干酪样坏死及结核结节形成，外周有纤维结缔组织和慢性炎性细胞浸润，周边可见朗罕细胞）后，均确诊为活动性肺结核；（3）痰标本病原学阳性肺结核者，对于痰标本病原学检测（包括涂片、培养和分子生物学检测等）为阴性的肺结核患者，采用BALF 和支气管镜下活检技术，进一步获取病原学和病理学证据者。排除标准：（1）属于非结核分枝杆菌肺病；（2）合并心、肾、肝等重要脏器性疾病；（3）免疫系统疾病；（4）凝血功能障碍；（5）妊娠期、哺乳期妇女；（6）肺外结核如：胸膜结核、骨关节结核等。本研究经昆明市第三人民医院医学伦理委员会审核批准，所有入选患者或其家属均签署知情同意书。

1.2 实验分组

按是否患有活动性肺结核进行分组，患有活动性肺结核的患者为实验组，同期健康体检者为对照组，根据纳入标准共纳入96 例患者作为实验组，同期健康体检者82 例作为对照组，2 组基线资料，性别、年龄、体重指数等，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.3 仪器及试剂

主要仪器：奥林巴斯全自动生化分析仪（型号：AU680，来源：美国贝克曼生物科技有限公司），流式细胞仪（型号：Bircyte E6，来源：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。主要试剂：细胞因子检测试剂盒（批号：210603，来源：青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司），AGP、AAT、HAP 检测试剂盒（批号：0320/04912、0124/05402L1、9033/03246L1，来源：迪亚莱博生物科技有限公司）。

1.4 研究方法

对入院后的研究对象采集静脉血2 mL 于EDTA-K2 抗凝剂的真空管中，充分混匀送至实验室检测，检测项目有：AGP、AAT、HAP、IgG、IgA、IgM、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、IFN-α、TNFα、CD3、CD4、CD8、CD4+/CD8+、CD45+、Bcell、CRP、NK-cell，标本检测操作方法均严格按照试剂说明书进行，在质量控制合格后完成，通过流式细胞仪Bircyte E6，全自动生化分析仪AU680 完成。

1.5 统计学处理

数据处理软件采用 SPSS Statistics 17.0 统计软件。服从正态分布的以均值±标准差（）表示，选择t检验；不服从正态分布的数据以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]，选择秩和检验；将单因素分析中P<0.05 的变量，使用多因素Logistic 回归分析，根据分析结果确定活动性肺结核发生的独立危险因素。基于多因素分析结果，应用R 软件中的rms 和pROC 安装包建立Nomogram 预测模型，根据计算结果绘制ROC 曲线，从而评估预测模型对活动性肺结核的预测价值，并绘制校准图。

2 结果

2.1 活动性肺结核患者的单因素分析

26 个因素中IgG 指标检测数据服从正态分布，采用经t检验，结果显示，实验组与对照组相比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。其余指标检测数据分布不服从正态分布，采用秩和检验，结果显示，与对照组相比实验组以下10个指标IgA、HAP、AGP、AAT、IL-6、IFN-γ、IFN-α、CD4、NK-cell、CRP，差异有统计学意义（P<0.05），是发生活动性肺结核的影响因素，见表1。

表1 活动性肺结核患者指标的单因素分析 [（ ）/M（P25，P75）]Tab.1 Univariate analysis of indicators in patients with active tuberculosis [（ ）/M（P25，P75）]

表1 活动性肺结核患者指标的单因素分析 [（ ）/M（P25，P75）]Tab.1 Univariate analysis of indicators in patients with active tuberculosis [（ ）/M（P25，P75）]

与对照组相比，*P <0.05，**P <0.01。

2.2 活动性肺结核患者指标的多因素Logistic 回归分析

将单因素分析结果中，差异具有统计学意义（P<0.05）的10 个相关因素作为自变量，见表2，将是否发生活动性肺结核作为因变量（0=有活动性肺结核，1=无活动性肺结核），采用向前逐步回归法，进行多因素Logistic 回归分析，最终结果显示AAT（OR=0.983，95%CI=0.968～0.999，P=0.039），IFN-γ（OR=0.783，95%CI=0.659～0.931，P=0.006），TNF-α（OR=1.495，95%CI=1.106～2.020，P=0.009）均与活动性肺结核发生的明显相关（P<0.05），其中TNF-α 的OR>1，P<0.05，为活动性肺结核的预测因子，见表3。

表2 发生活动性肺结核危险因素及其赋值Tab.2 Risk factors for developing active pulmonary tuberculosis and their value assignments

表3 活动性肺结核患者指标的多因素Logistic 回归分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of indicators in patients with active tuberculosis

2.3 列线图预测发生活动性肺结核风险

根据因素Logistic 回归模型计算结果，应用R 软件中的Nomogram 模型对各影响因素进行评分，每个预测指标刻度线的数值即为所得分数，总得分为所有指标相应的分数相加，总得分代表发生活动性肺结核的风险。由列线图可知在此模型中IFN-γ 是发生活动性肺结核的最强预测因子，然后是TNF-α 和AAT，见图1。

图1 活动性肺结核危险因素Nomogram 预测模型图Fig.1 Nomogram predictive model diagram of active tuberculosis risk factors

2.4 列线图的检验

采用自助法（Bootstrap）对列线图模型进行验证，其中ROC 曲线的分析结果显示：曲线下面积为0.728（95%CI：0.655～0.801），说明本模型预测能力良好，见图2。Nomogram 预测模型校准图结果显示，校准预测曲线与理想曲线贴合良好，说明该模型有良好的预测精准度及区分度，见图3。

图2 Nomogram 预测模型的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of the Nomogram prediction model

图3 Nomogram 预测模型的校准图Fig.3 Calibration diagram of the Nomogram prediction model

3 讨论

我国的肺结核疫情十分严峻，活动性判断是肺结核的诊治中不可或缺的环节[12]，目前临床上的“金标准”存在诸多不足，如假阴性或假阳性率高等问题，寻找新的活动性评价标准迫在眉睫。临床上对于活动性肺结核的诊断主要通过实验室及病理学检查，无法进行大规模检测，不利于阻止肺结核的传播，而通过列线图模型可以将发病风险及高危因子进行量化，更加精准、直观的用数字表现出活动性肺结核患病风险的概率，通过监测高危因子能有效筛查活动性肺结核患者，阻止肺结核的传播，目前我国外周血检测技术越来越成熟，已具备大规模筛查的能力。同时活动性肺结核患者外周血指标的研究愈来愈热，活动性肺结核患者外周血中CD44 与健康人群相比表达水平明显增高，当CD44 表达水平异常时，患者血清中TNF-α 和IFN-γ 表达水平也异常增高[13]。同时患者血浆中 IL-6，IL-17，IL-37 及TIM-3 水平也有明显升高的趋势[14]。程静等[15]对活动性肺结核患者肺泡灌洗液进行检测时发现，患者血清中IFN-γ、IL-12、IL-35 水平明显升高，这些证据都表明细胞因子对肺结核活动性评价具有重要意义。

近年来牛文一、郑梓坤等[16−19]通过对比活动性患者与健康人群外周血中的细胞亚群及细胞因子，进行单因素方差分析得出CD3、CD4 以及血清中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17 对活动性肺结核诊断具有一定的价值，但大部分研究纳入的指标单一，很难做出准确的判断，因此有必要建立准确、客观的活动性肺结核诊断预测模型。为此本研究提出一种基于AAT 与细胞因子构建活动性肺结核的预测模型方案，考虑到活动性肺结核是一个复杂的、多因素、多系统的病变过程[20]，本研究纳入活动性肺结核患者的26 项指标，将单因素分析结果进行二元Logistic 回归分析，以期能快速识别肺结核患者的活动性，便于患者早期临床诊治，提高患者的预后及生存率。

与其他研究相对比，本研究基于单因素分析结果中具有统计学差异的相关因素进行逻辑回归分析，并对分析结果纳入列线图模型，其研究结果显示TNF-α、IFN-γ、AAT 均是活动性肺结核的预测因子。当TNF-α 异常时，会改变中性粒细胞（NE）的吞噬能力，促进NE 粘附到内皮细胞上，刺激机体产生局部炎症反应[21]，引起慢性炎性细胞浸润，诱发患者多发性结节状病灶的产生，属于活动性肺结核患者影像学及实验室诊断标准，同时使AAT 的水平异常升高，这可用于区分急性、亚急性与慢性肺结核。IFN-γ 则是Th1型细胞分泌的细胞因子，这类细胞因子能够增加巨噬细胞的活性[22−23]，对活动性肺结核的发展具有非常重要的影响。IFN-γ 释放实验也是确认病原体感染较为可靠的方法，具有早期诊断价值[24−25]。研究结果表明相较于其他临床指标，TNF-α、IFN-γ、AAT 3 者更具有特异性，对于活动性肺结核诊断具有重要的价值。

为了建立量化的活动性肺结核风险预测模型，对患者患病风险进行评估，识别活动性肺结核高危人群，实现早期治疗，改善肺结核的预后。本研究将回归分析结果利用Nomogram 预测模型使预测结果可视化，使预测模型更具可读性。本次研究中，列线图检验结果显示，C-index 指数为0.728（95%CI：0.655～0.801），说明本研究所列Nomogram 模型具有较好的区分度与精准度。同时外部验证结果显示校准曲线与标准曲线有较好的拟合度，证实预测值与实际值一致性较高，表明本模型有较高的预测准确率。同时在后续研究中将收集更多的外部数据对该模型的准确率进行验证。

本研究尚不足之处：（1）血清学检查作为肺结核活动性的判断证据级别较低，临床应用时需结合影像学检查和患者临床症状进行综合判断；（2）活动性肺结核主要引起感染、炎症改变等不典型性症状，这导致容易受患者免疫功能状况影响；（3）本研究中应用的是Nomogram 模型，只是众多疾病预测模型中的一种，在接下来的工作中，本课题组将对患者进行随访，同时扩大样本量，开展多中心研究，建立不同方法组合的模型，构造适用范围更广、更加准确的预测模型。

综上所述，活动性肺结核是一个复杂的、多因素、多系统的病变过程[26]，其活动性的评价需从多方面进行考证。经检验AAT、IFN-γ、TNFα 指标异常均与活动性肺结核的发生明显相关，基于上述危险因素建立的Nomogram 模型具有良好的预测效能，可为活动性肺结核的实验室诊断提供一定的参考价值。