Smad4 与嗅觉系统功能及疾病的研究进展

张 切 ，王淑芬 ，曹守明 ，吴海莺

（1）昆明医科大学第二附属医院耳鼻咽喉科,云南 昆明 650101;2）昆明医科大学生物医学工程研究中心云南省干细胞和再生医学重点实验室,云南 昆明 650500）

嗅觉系统不仅是人类进化史上最古老的感官之一，也是人类出生后就即刻使用的感官之一[1]。嗅觉不仅包括辨别气味，还包括对信息素的编码，从而起着预警危险、影响食欲、调节情绪等作用。嗅觉系统如果受到损伤，会直接影响患者的生活质量，严重的还会给患者的精神状态造成负面影响。深入了解SMAD4 在嗅觉系统及其在嗅觉相关疾病中的作用，不仅有助于在微观领域揭示嗅觉相关基因的功能，而且能为下一步对信息素、鼻腔肿瘤等的研究提供有效的参考和重要的启示。

1 Smad4 简介

人类的Smad4 位于染色体 18q21.1 上。目前已知的Smads 蛋白至少有9 种，即Smad1～Smad9。其中Smad4 蛋白由552 个氨基酸残基组成的[2]。Smad4 蛋白的肽链中包含N 区（MH1，mad homology domain 1）和C 区（MH2，mad homology domain 2）。Smad4 蛋白的MH2 能够结合受体 激酶[2]。SMAD4 是TGF-β 信号通路的中心调节因子，而TGF-β 信号通路在细胞生长、分化、凋亡、迁移以及癌症的发生和发展等许多生物学过程中发挥着重要作用，SMAD4 作为一种肿瘤抑制因子在多种癌症中发挥重要作用。

2 SMAD4 与嗅觉系统的功能

2.1 嗅觉系统的结构

主嗅系统（Main olfactory system）和副嗅系统（Accessory olfactory system）是嗅觉系统的2 大组成部分。主嗅系统包括嗅上皮、嗅球、嗅觉皮层；副嗅系统即犁鼻系统或犁鼻器（Vomeronasal organ），包括 Apical 和 Basal 犁鼻骨感觉神经元和副嗅球[3]。嗅觉感觉神经元和犁鼻感觉神经元的信息传递的具有互补特征。嗅觉感觉神经元的阶段性放电适用于在较短的周期（<200 ms）内携带有关快速变化的信息。相比之下，犁鼻感觉神经元的强直放电能够传达关于较小刺激随着较长周期（>500 ms）缓慢变化的信息。因此，这2 种感觉神经元的平行通路可以传达有关各种动态刺激的信息。嗅觉信息传递的互补特征的组合可以增强主要嗅觉系统和犁鼻系统之间相互作用的协同作用[4−5]。

2.2 嗅觉的产生机制

嗅觉的产生依赖于气味分子与嗅觉受体的结合。嗅觉受体存在于嗅神经元上，是一种G 蛋白偶联受体（Golf）。空气中的化学物质通过呼吸，被嗅上皮部分的黏液吸收，直接或间接地与嗅觉受体结合。尽管嗅觉受体与气味分子并非是一对一识别的关系，同一个气味分子会拆解为多个部分分别被多个嗅觉受体识别[1]。嗅觉受体属于气味分子与嗅觉受体结合后激活 Golf，活化的Golf进一步激活腺苷酸环化酶Ⅲ，提高胞内第二信使环磷酸腺苷（cAMP）浓度，从而打开细胞膜上的环核苷酸门控阳离子通道，引起钙离子内流、氯离子外流，导致细胞去极化，行成动作电位，动作电位再通过嗅丝传导至嗅球[6]。嗅小球将动作电位传递，激活嗅球上的神经元，即僧帽细胞。接着嗅束把信息传递到更高的主嗅系统组成部分，即嗅觉皮层，便产生了嗅觉[5]。

嗅觉系统与边缘系统关系紧密。嗅球会将汇总的气味信息投射至海马体（唤起与该气味有关的记忆）、投射至杏仁核（调出该气味“好坏”的标签）。嗅觉刺激的产生除了气味分子之外，还有信息素（又称费洛蒙）。不同的物种，其接受信息素和一般气味分子的编码可能由犁鼻器和嗅上皮分别进行，也可能同时由两者编码[7−8]。目前已知的如外分泌腺分泌肽22 由犁鼻器编码；甲硫基甲硫醇、雄烯酮这些信息素由主嗅觉系统编码。对于人类的性信息素，目前仅有雄甾二烯酮和雌甾四烯[9−15]被认为很可能是有用的人类性信息素。人类嗅觉对不同信息素的心理和生理反应也可能不太一样。已经有越来越多的证据表明人类信息素的存在，但其潜在的机制仍然不清楚。特别是在嗅觉系统如何编码信息素从而进一步对人类产生影响，还有很多值得研究的地方。

2.3 SMAD4 与嗅觉神经的关系

2.3.1 Smad4 信号通路与犁鼻感觉神经元（VSN）的关系Smads 基因存在于细胞质中，是哺乳动物体内TGF-β 信号转导途径中的重要基因家族，是已被证实的 TGF-β 受体激酶的底物。Smads可将信号由细胞膜直接传至细胞核。目前已知至少存在9 种Smads 分子，按结构和功能可分为3个亚型：受体激活型、通用型、抑制型。Smad4属于通用型，能与活化的 R-Smad 形成异聚体，在信号转导中发挥关键作用[4]。Smad4 基因编码的蛋白可以被跨膜丝氨酸/苏氨酸受体激酶激活，如转化生长因子 TGF-β 受体。Smad4 作为 TGFβ 信号的重要胞浆内信号级联分子，能够以同源复合物或者异源复合物的形式，转移到核内。同时，SMAD4 会与其他转录因子协同作用，调节TGF-β 应答基因的转录。Smad4 的表达或功能的改变，都会使TGF-β 的信号转导出现异常，甚至是影响肿瘤的形成过程[16−18]。

Smad4 信号在 basal-VSN 的成熟、功能和精确连通性方面起着关键作用，Smad4 的突变会导致 TGF-β/BMP 信号通路破坏，引起 basal-VSN的进行性功能缺失，减少对 basal-VSN 的激活，导致后部副嗅球形成的异常，导致嗅觉传导异常[4−19]。

2.3.2 Smad4 介导的信号驱动了基础犁鼻感觉神经元（VSN）的功能成熟和连接2020 年，Ankana S.Naik 等[20]为了测试 TGF-β/BMP 信号在不同细胞环境中的作用，利用AP-2εCre 和OMPCre小鼠系作为破坏Smad4 功能的基因切入点，分别破坏未成熟基底 VSN 和成熟顶端和基底 VSN 中的Smad4 功能。结果表明未成熟基底VSN 中Smad4 依赖性形态发生信号是完成基底VSN 细胞成熟所必需的，并且未成熟和成熟基底VSN 中的Smad4 依赖性信号对于基底VSN 和AOB 之间的正确电路形成至关重要。成熟的基底VSN 中的条件Smad4 消融导致成年小鼠基底神经元的严重损失，并且损害神经元对气味刺激的反应[20−21]。

2.3.3 Smad4 对人类嗅觉系统的影响SMAD4作为经典的转录调控因子，本身在TGF-β 信号转导通路中发挥重要的调控作用，但也有SMAD4对可变剪接潜在的调控作用，在siRNA 的作用下诱导Bim 的可变剪接短亚型的表达的观点。嗅觉神经发育相关的高通量测序数据表明嗅觉投射神经元（传递嗅觉信息到脑高级区域）发育过程中可变剪接水平存在广泛的变化，WT1 的可变剪接亚型（+KTS）的表达对于嗅觉上皮的发育具有重要的促进作用。另一方面，由于目前人类嗅觉系统对信息素的编码尚未有定论，人类对信息素的编码可能有的发生在副嗅觉系统，有的则发生在主嗅觉系统，因此SMAD4 很可能还会通过对嗅觉神经的调控影响对信息素的编码从而影响人类的行为，特别是生殖和社会行为。

信息素这种化学信号在同一物种的成员之间传递信息，它们与中枢神经系统和神经内分泌系统之间错综复杂的相互作用则不太为人所知。在关于人类信息素的研究结果中，自1971 年第1 份关于人类月经同步的报告以来，近50a 的研究表明，人体分泌物，特别是腋下汗水，潜意识地传达情感和生殖状态，反过来又由复杂的神经化学变化驱动。在人体分泌物的许多成分中，雄甾二烯酮（androsta-4，16，-dien-3-one，一种性腺孕酮的非雄激素衍生物）和雌甾四烯（estra-1，3，5（10），16-tetraen-3-ol，与雌激素性激素有关但没有已知的雌激素作用），这2 种内源性类固醇是人类性信息素的候选者[22]。国外有研究团队进一步根据研究成果总结出人类的4 类信息素[23]。第1 种引发快速而可靠的行为，称为直效信息素Releaser pheromone）。第2 种是使吸入该种信息素的对象内分泌发生的变化的启动信息素（Primer pheromone）。第3 种为通讯信息 素（Signaler pheromone），它能传递释放者的关键信息。第4种是调节信息素（Modulator pheromone），是可以使接收者的情绪起伏乃至认知发生变化的信息素，如：焦虑状态下分泌的汗液能够消除阈下积极面部表情所产生的情绪启动效应[23−24]，同时使惊跳反射变得强烈[23]；研究对象的情绪会受到不同状态下分泌的汗液气味的影响，例如闻到恐惧状态下分泌的汗液不仅情绪知觉会变化，其反应也会变慢[24−25]；闻到厌烦或开心状态下分泌的汗液，其面部表情、呼吸甚至认知反应都会有相应的改变[26−27]。更有研究发现，没有明显气味的人的眼泪也可能包含信息素，并影响接收者的生理状态[28]。

3 SMAD4 与嗅觉相关肿瘤的关系

3.1 SMAD4 与肿瘤的关系

如前所述，Smad4 蛋白可与TGF-β 上的TGF-β I 型受体相结合，并将其激活。TGF-β是重要的转录生长因子，具有调控细胞增殖的作用。当Smad4 的核表达缺失时，TGF-β 信号会发生断裂，使肿瘤细胞摆脱 TGF-β 的调控，从而可导致肿瘤细胞出现不可逆的异常增殖和生长[29]。目前已有的研究均一致认为SMAD4 是一种抑癌基因。如在食管癌、胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤中，多数研究表明Smad4 常常发生基因变异[30−31]。其具体的机制包括：Smad4 的点突变可通过 GSK-3 的磷酸化作用从而可逆地使TGFβ 信号失活；Smad4 可抑制VEGF-C 的分泌，并抑制淋巴管的生成，从而降低肿瘤的转移及侵袭能力；TGF-β 通过SMAD4 及SP1 协同转录上调LAMC1 的表达；体外功能实验也显示，LAMC1通过抑制凋亡促进肿瘤细胞增殖，且通过激活Akt/NF-κB/MMP9，MMP14 促进肿瘤细胞迁移[32]。大量的临床研究证实，SMAD4 可作为诊断、治疗消化道肿瘤及评估消化道肿瘤患者预后的重要标志物。在与女性生殖系统肿瘤的研究中，发现在体外试验中，SMAD4 可抑制体外部分乳腺癌细胞的生长[33]；在乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-468 中，SMAD4 既可单独，也可通过与SMAD3形成复合物的形式呈剂量依赖性抑制ERα介导的转录活性[33]。已有研究表明[33]，CIN 和宫颈鳞癌中SMAD4 表达异常（表达减少），可使TGF-β信号传导减弱或中断，导致相关的生长抑制作用受抑制。因此细胞连续增殖，进而诱发CIN，甚至癌变[33]。Mackenzie 等[34]研究发现，黏液性卵巢癌存在低水平的Smad4 基因突变，并且BMP9（骨形态发生蛋白9）可通过ALK2/ActRIIA/BMPRII/ Smad1/ Smad4 途径诱导卵巢癌细胞增殖。在肺癌中发现了Smad2 和Smad4 在18q21 上存在不良突变[35]，TGF-β1 基因多态性与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）风险的增加有关[36]。

3.2 SMAD4 与与嗅觉相关肿瘤

鼻腔鼻窦恶性肿瘤少见，仅占头颈部恶性肿瘤的3%～5%。而且病理类型繁多主要包括嗅神经母细胞瘤、鳞癌、腺癌、未分化癌、神经内分泌癌、恶性黑色素瘤、腺样囊性癌、血管周细胞瘤、淋巴瘤和软组织肉瘤等[37]。目前有研究表明与SMAD4 有关的鼻腔鼻窦恶性肿瘤有嗅神经母细胞瘤（factory neuroblastoma，ONB）[38]。ONB 又称嗅神经细胞瘤、神经上皮瘤或成感觉神经母细胞瘤等，是一种罕见的、局部侵袭性、起源于嗅上皮的恶性肿瘤。由于发病率较低（0.4/100 万，占所有鼻腔肿瘤的2%～3%）且早期症状不典型，相关的研究较少。ONB 确切起源存在争议，目前普遍认为其来源于嗅神经上皮基底细胞，最常见的原发部位为鼻腔顶筛板区。2017 年Topcagic J等[39]对23 例复发或转移性ONB 患者（10 例男性，13 例女性，年龄29～84 岁）的样本进行基因检测，发现在63%的标本中检测到突变，包括 TP53、CTNNB1、EGFR、APC、cKIT、cMET、PDGFRA、CDH1、FH 和 SMAD4 基因。

从目前的研究进展来看，一方面，尽管目前发现的SMAD4 与嗅觉特别是嗅觉障碍之间的关系主要是来自动物实验，且对嗅觉的影响主要通过副嗅系统，而人类的副嗅系统已处于退化。然而目前人类嗅觉系统对信息素的编码尚未有定论，人类对信息素的编码可能有的发生在副嗅觉系统，因此SMAD4 很可能还会通过对嗅觉神经的调控影响对信息素的编码从而影响人类的行为，因此深入了解SMAD4 在嗅觉神经系统中的调控作用，不仅有助于在微观领域揭示嗅觉相关基因的功能，而且能为下一步对信息素的研究提供有效的参考和重要的启示。另一方面，尽管已经明确SMAD4是一种抑癌基因，但由于鼻腔鼻窦恶性肿瘤少见，用于全面大规模研究的肿瘤组织样本有限，对其遗传学、分子生物学或发病机制知之甚少，然而识别这些肿瘤的分子异常对特异性靶向治疗的研究至关重要。因此SMAD4 在鼻腔鼻窦恶性肿瘤中的作用机制还有待进一步研究且意义深远。