预先切口浸润氟比洛芬酯对切口痛大鼠术后疼痛及炎症细胞因子的影响

江磊 贾子普 罗芳

(首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100050)

手术的机械损伤可直接刺激外周的伤害性感受器，手术创伤也可引起术区炎症反应，间接刺激伤害性感受器，伤害性刺激逐级传递致大脑皮层感觉中枢，从而使大脑感知到疼痛〔1，2〕。术后疼痛又称伤害性疼痛，是手术即刻发生的急性疼痛，主要表现是自发性疼痛、触诱发痛和痛觉过敏，是临床最常见的急性疼痛类型〔3，4〕。术后疼痛影响患者循环、呼吸、消化及内分泌等各系统功能，导致术后一系列并发症，影响术后恢复。

氟比洛芬酯是一种具有靶向作用的新型非甾体类镇痛脂质微球〔5〕。氟比洛芬酯的载体是脂质微球，可以使药物更好地传递到疼痛部位发挥作用，具有良好的抗炎和镇痛疗效，具有用量小、不良反应少、镇痛效果好的优点〔6〕。研究表明氟比洛芬酯可以有效抑制术后疼痛引起的应激反应，减少术后并发症，促进患者恢复〔7～9〕。已有研究报道氟比洛芬酯静脉注射用于腹部、骨折、肿瘤手术患者术后镇痛〔10～12〕。预先在切口局部浸润氟比洛芬酯的术后镇痛作用及其可能的机制目前仍未见报道。本研究利用大鼠切口痛模型，通过预先局部浸润不同浓度氟比洛芬酯对术后镇痛的影响，筛选出最适宜的浓度。利用适宜浓度氟比洛芬酯研究其对炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及IL-6表达水平的影响，明确切口预先局部浸润氟比洛芬酯的术后镇痛作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 健康成年雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，8周龄，由维通利华公司实验动物中心提供。实验室笼养，自由饮水，室温(22±2)℃，湿度保持在40%～60%，光照周期8∶00～20∶00。大鼠入室后分笼饲养，适应环境1 w。本研究已获得北京天坛医院实验动物伦理委员会批准。

1.2主要仪器和试剂 电子冯弗雷纤维丝测痛仪(Electronic von Frey anesthesiometer，IITC Inc)；麻醉机(Drager Fabius，德国Drager公司)；自制玻璃麻醉诱导箱；Gen5酶标仪(美国BioTek公司)；CF16RX恒温离心机(日本HITA-CHI公司)；光热甩尾测痛仪(上海软隆科技发展有限公司，型号：BW-YLS-12A)。氟比洛芬酯注射液(凯纷)购自北京泰德制药有限公司提供。七氟烷、生理盐水购自国药集团容生制药有限公司；大鼠TNF-α、IL-1β、及IL-6试剂盒均购自美国R&D公司；Von Frey购自美国Stoelting公司；热辐射刺激仪购自意大利Ugo公司；多聚甲醛固定液(G1101-500ML，Servicebio)；无水乙醇(100092683，国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(10023418，国药集团化学试剂有限公司)；苏木素-伊红(HE)染液套装(G1003，Servicebio)；中性树胶(10004160，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3大鼠切口痛模型建立 参照Brennan等〔13〕的方法制备大鼠足底切口痛模型，将实验大鼠称重后置入麻醉箱中，麻醉箱一侧接麻醉机，采用3%七氟烷麻醉诱导，待麻醉平稳后将大鼠取出，俯卧位固定于手术台上，经鼻罩给予七氟烷继续维持麻醉后切割大鼠左后足。从足跟近端0.5 cm处向趾部作一纵行切口，长度约1 cm，切开左后足的皮肤及筋膜，用眼科镊轻轻挑起足底肌肉并作纵向切割，压迫止血后用丝线缝合。手术后将大鼠置于避光、安静、温暖的环境下苏醒，苏醒后左后足无运动障碍，手术结束30 min后左后足不着地且有咬、舔现象为造模成功。

1.4最佳给药浓度的筛选

1.4.1动物分组 造模成功大鼠24只分为对照组(生理盐水)、低浓度组(氟比洛芬酯5 mg/ml)、中浓度组(氟比洛芬酯7.5 mg/ml)及高浓度组(氟比洛芬酯10 mg/ml)，对照组给予0.5 ml生理盐水，药物组给予0.5 ml不同浓度氟比洛芬酯行预先切口局部浸润。

1.4.2机械缩足阈值(PWT)测量 选用8根强度呈对数递增的(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14)冯弗雷纤毛机械刺激针(VFH)垂直刺激大鼠左后足底，从2.04开始，以探针轻微弯曲并持续2～3 s为准，每次刺激间隔30 s，如大鼠出现快速撤足为阳性反应。若反应阴性，选用刺激强度呈对数递增的相邻VFH继续刺激；若撤足反应为阳性，则选用相邻递减的刺激强度给予刺激。以出现第1次阳性反应前的阴性反应作为起点，选择包括该点在内的6次连续刺激，50%PWT=10(Xf +κδ)/104 (Xf：序列中最后一根VFH的对数值；κ：根据测量所得序列查表后得到的值；δ=0.224)。

1.4.3累计疼痛评分(CPS) 将大鼠置于透明有机玻璃箱中适应30 min，待大鼠停止探觅行为且恢复安静后，开始进行CPS测量。测量方法为观察其术侧后肢着地和负重的情况，术侧后肢着地且被压迫致发白表示负重；术侧后肢因为疼痛而翘起不着地计2分；术侧后肢着地但不负重计1分；术侧后肢着地并负重计0 分。每5 min观察1次大鼠的行为变化，每次观察1 min，在观察的1 min内大鼠最常采用的站立姿势作为疼痛评分记录，共观察1 h(即12次)，将12次疼痛评分的总和计为该时点的CPS。

1.4.4筛选最佳的氟比洛芬酯浓度 于造模前(T0)、造模后2 h(T2)、6 h(T6)、12 h(T12)、24 h(T24)及48 h(T48)行大鼠切口痛行为学和切口红肿、渗血、不愈合等安全性指标观察，筛选出最佳药物浓度。

1.5最佳给药浓度下氟比洛芬酯对切口痛大鼠的干预。

1.5.1动物分组 大鼠36只随机等分为对照组(生理盐水组)和药物组(最佳浓度氟比洛芬酯组)，分别预先切口局部浸润生理盐水或筛选出最佳浓度的氟比洛芬酯各0.5 ml后建立切口痛模型。对照组给予0.5 ml生理盐水，药物组给予0.5 ml最佳给药浓度的氟比洛芬酯行预先切口局部浸润。

1.5.2PWT和CPS测定 于T0、T2、T6、T12、T24及T48时分别按照1.4.2和1.4.3的方法进行PWT和CPS测定，比较对照组和药物组的疼痛指数。

1.5.3酶联免疫吸附试验(ELISA) 于T0、T2、T6、T12、T24及T48时，3%水合氯醛腹腔注射，将大鼠麻醉后，迅速用乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝采血管采集心房血液2 ml，将取得的血液放入离心机中以3 000 r/min离心15 min，取上清液即血浆放入EP管中，参照说明书检测血浆中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度。

1.6统计学处理 采用SPSS21.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1氟比洛芬酯最佳给药浓度的筛选

2.1.1各组PWT比较 T0时各组PWT值无统计学差异(P>0.05)。造模后，各组各时间点PWT均低于T0，尤以T2下降明显，随后各组PWT呈上升趋势，直至T48仍低于T0。低、中、高浓度组PWT值于T12、T24、及T48时明显升高(P<0.05)。见表1。

2.1.2各组CPS比较 T0时各组无统计学差异(P>0.05)。模型建立后各组CPS迅速上升，尤以T2上升明显，随后各组CPS呈下降趋势，直至T48仍高于T0。T12、T24及T48时低、中、高浓度组CPS明显低于对照组(P<0.05)，见表2。

2.1.3副作用 低、中、高浓度组术后不同时间点未见伤口肿胀、渗血、感染、不愈合等副作用。

2.1.4最佳浓度 按照最低有效的原则，本研究中5 mg/ml氟比洛芬酯为最佳的浓度。

2.2对切口痛大鼠的干预作用及对炎症细胞因子的影响

2.2.1两组PWT和CPS比较 造模后，两组PWT值明显下降，尤其以T2下降明显，随后逐渐上升，但直至T48仍低于T0。与对照组比较，药物组T12、T24及T48时PWT值明显升高(P<0.05)。建模后，两组的CPS值迅速上升，尤其以T2升高明显，随后逐渐下降，但直至T48仍高于T0。与对照组比较，药物组T12、T24及T48时CPS明显降低(P<0.05)，见表3。

2.2.2两组IL-1β、IL-6、及TNF-α水平比较 与T0相比，对照组和药物组术后T2、T6、T12、T24及T48时IL-1β、IL-6、及TNF-α的表达均有所增高；与对照组相比，T2和T6时药物组IL-1β和IL-6水平明显降低(P<0.05)，见表4。

表1 4组疼痛行为学PWT比较

表2 4组疼痛行为学CPS比较分，n=6)

表3 两组PWT和CPS比较

表4 两组IL-1β、IL-6及TNF-α水平比较值)

3 讨 论

Brennan等〔13〕首次建立大鼠切口痛模型，证明了术后术侧后爪能表现出明显的自发性疼痛行为、触诱发痛、机械性痛觉过敏及热痛觉过敏。该模型术后0.5 h出现明显的痛觉过敏，2 h达到峰值，且可持续到术后4～7 d〔14〕。本研究与Brennan等〔13〕报道一致，表明造模成功。不同浓度药物组预先切口局部浸润不同浓度氟比洛芬酯后造模，各药物组造模后疼痛程度也显著增加，同样证实造模成功。本研究结果证实，预先切口局部浸润各浓度氟比洛芬酯均有明显减轻大鼠机械性痛觉过敏、防治切口疼痛的作用。本研究结果还提示，局部浸润氟比洛芬酯对于术后切口痛的早期镇痛效果欠佳，12 h后局部浸润氟比洛芬酯的术后镇痛效果才显著优于生理盐水；而且，本研究发现，虽然术后48 h药物组的疼痛程度优于对照组，但各药物组造模后48 h与基础值比较，疼痛程度仍未恢复到造模前，说明术后疼痛仍未完全控制，因此，氟比洛芬酯尽管对于切口疼痛具有一定的防治作用，但疗效有限，今后可考虑术后配合其他多模式镇痛方法，如联合应用长效的局部麻醉药，以改善术后疼痛的管理水平。

氟比洛芬酯镇痛作用的主要机制是抑制环氧化酶(COX)生成，从而阻断前列腺素(PGs)的生物合成，减少损伤部位的致痛物质和炎症介质的生成和释放。氟比洛芬酯脂质微球的优势有3个方面，(1)靶向性：脂质微球能使氟比洛芬酯在血供较为丰富的手术切口及炎症部位聚集，继而水解为氟比洛芬，从而增强药效；(2)缓释性：脂质微球有助于控制氟比洛芬酯的释放，使药效持续时间更长；(3)转运性：脂质微球使氟比洛芬酯易于跨越细胞膜，从而促进其药物的吸收，缩短起效时间〔15〕。目前，氟比洛芬酯静脉给药、作为一种靶向镇痛作用的制剂通过上述机制发挥镇痛的作用。本研究发现，预先切口局部浸润氟比洛芬酯达到了较好的术后镇痛效果，证实了局部应用氟比洛芬酯即使很小的剂量即有显著的镇痛作用，为临床上合理用药提供良好的实验依据。采用局部浸润氟比洛芬酯脂质微球的给药方法，氟比洛芬酯可直达患处，从而达到抗炎镇痛作用，理论上可能较静脉应用氟比洛芬酯脂质微球用量少、病灶局部药物浓度高、效果更直接，有望成为一种安全有效的术后镇痛手段。

组织损伤后局部释放大量致痛物质，同时术区出现无菌性炎症反应，可导致急性疼痛及痛觉过敏〔16，17〕。手术创伤等伤害性刺激可导致炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等释放。IL-1β和IL-6是诱导全身炎症如急性期反应的主要促炎细胞因子，主要由T细胞、B细胞及单核巨噬细胞等合成，正常情况下人体血清中含量较低，而机体存在炎症时血清中IL-1β及IL-6水平明显升高〔18〕。IL-1β和IL-6主要作用于血管内皮细胞引起通透性增加，进而引起大量炎症细胞渗出，导致明显的外周痛觉过敏。前期研究表明在大鼠切口痛模型中，IL-1β表达水平升高〔19〕。先前研究发现手术创伤后患者出现血清IL-6水平升高，因此IL-6被认为是反映应激程度的敏感指标〔20〕。IL-6对机体手术创伤刺激和感染起重要调节作用，在手术创伤局部大量产生并进入循环系统，是急性期炎症细胞聚集的主要因素，被认为与术后疼痛程度密切相关〔21，22〕。这些细胞因子可以通过直接或间接作用于伤害性感觉神经元上的受体，激活神经元内的p38丝裂酶原活化蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C等多种复杂信号传导通路，降低周围神经元的兴奋阈值，产生外周敏化，使得低强度的阈下刺激也可导致疼痛。本研究结果提示氟比洛芬酯有可能通过降低IL-1β和IL-6起到术后镇痛的作用。本研究存在以下局限性。首先，本研究仅观察到术后48 h的疼痛变化，切口痛模型术后疼痛可持续到术后4～7 d，今后应进一步延长观察的时间。目前，术后疼痛机制主要由中枢敏化和外周敏化所致，前期研究表明外周神经及组织损伤后将导致前列腺素、缓激肽、IL-1β、IL-6及TNF-α等升高，尤其是炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等对伤害感受器致敏，导致明显的外周痛觉过敏〔23〕。前期研究报道，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症介质在不同的动物模型中证明能够提高痛觉过敏症状〔24〕。本研究仅探讨了IL-1β、IL-6及TNF-α这3种炎症细胞因子的变化，今后，有待开展深入的研究探讨其他可能涉及的镇痛防治作用机制。最后，还需要进一步研究该技术的具体实施细则，如氟比洛芬酯理想的给药时机、给药方式等。

大鼠切口痛模型可获得应用于人类急性疼痛模型的实验数据，因此，本研究结果有望为减轻患者术后疼痛、应激和炎症反应提供新技术，为临床术后镇痛提供合理用药临床依据。