罗哌卡因对宫颈癌细胞C-33A生长、侵袭和间质转换的影响及裸鼠移植瘤生长的调节

陈洪霞 叶元梅 何光权 任普圣 康道林 赵蕾 杨玉萍

(1川北医学院附属医院麻醉科，四川 南充 637000；2兰州大学第一医院麻醉科；3南充市中心医院麻醉科；4南充市西充县妇幼保健院妇产科)

宫颈癌是全世界女性中第四大最常见的肿瘤类型，也是癌症相关死亡的第四大主要原因〔1〕。人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要原因之一，通过细胞学筛查和HPV DNA检测可以降低宫颈癌的发病率和死亡率，但宫颈癌许多患者在晚期在才被诊断，这些患者的预后极差，5年生存率不到40%〔2〕。宫颈癌的治疗包括手术切除，放射治疗及化学疗法，但是，没有标准疗法可用于转移性宫颈癌患者〔3〕。近年来研究〔4，5〕发现，在手术过程中使用的麻醉药物可以在一定程度上抑制癌症的复发，因此探讨麻醉药对宫颈癌细胞的影响具有重要意义。

罗哌卡因是一种氨基酰胺长效局部麻醉药，临床上常用于腹腔内喷洒与切口浸润可明显减轻宫颈癌患者术后疼痛〔6〕。越来越来多研究表明，罗哌卡因对肿瘤具有抑制作用，如通过调控Na+通道的开放明显抑制结肠癌细胞的侵袭和转移能力〔7〕，抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖能力〔8〕。但罗哌卡因对宫颈癌具体作用机制还未见报道，本文旨在探究罗哌卡因对宫颈癌细胞C-33A生长、侵袭和间质转换的影响及裸鼠移植瘤生长的影响。

1 材料和方法

1.1试验药物和主要试剂 罗哌卡因(S68348)购自上海源叶生物科技有限公司，化学式：C17H26N2O，分子量：274.4 D，纯度≥98%；RPMI1640培养基(61870-127)、青霉素-链霉素溶液(15140-122)、胎牛血清(26400-036)和胰蛋白酶(25200-056)均购自美国Gibco 公司；细胞计数试剂(CCK)-8试剂盒(G021-1-1)、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡原位检测试剂盒(G002-1-2)购自南京建成生物工程研究所；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖检测试剂盒(C0085L)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(P0012)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208)均购自上海碧云天生物技术研究所；Transwell(353090)购自美国BD公司；兔抗单克隆抗体纤维黏连蛋白(Fibronectin,ab2413)、波形蛋白(Vimentin，ab194719)和GAPDH(ab37168)均购自英国Abcam公司。

1.2细胞培养 人子宫颈癌C-33A细胞株来源于中国典型培养物保藏中心，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中用高糖RMPI1640培养基(含10 %胎牛血清和1 %青霉素-链霉素)培养，每3 d更换1次培养基，收集细胞时用0.25%胰蛋白酶消化，试验选用对数生长期细胞。

1.3CCK-8 选用对数生长期细胞，将宫颈癌C-33A细胞以100 μl/孔接种于96孔板中孵育24 h，加入不同剂量罗哌卡因(0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L)继续培养24 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液避光孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定各孔的OD值并计算细胞存活率，根据细胞存活率计算IC50值。

1.4细胞处理及分组 根据方法1.3结果，选择1 mmol/L剂量罗哌卡因为最高剂量，数递减剂量确定给药梯度为：1.00、0.50、0.25 mmol/L。将细胞随机分为4组：罗哌卡因0.00 mmol/L组、罗哌卡因0.25 mmol/L组、罗哌卡因0.50 mmol/L组和罗哌卡因1.00 mmol/L组。

1.5EDU染色 取对数生长期的C-33A细胞以每孔1×105接种于96孔板，培养过夜，在每孔中加入100 μl含50 μmol/L EDU培养基孵育2 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，每次5 min。将细胞进行固定和染色后用荧光显微镜进行观测。

1.6Transwell检测细胞侵袭 将各组C-33A细胞接种至Transwell上室中，于下室中加入无血清培养基，置于37℃培养箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS冲洗2次，5% 戊二醛固定，0.1%结晶紫染色0.5 h后于荧光显微镜下观测，随机选择5个视野对细胞进行计数，侵袭细胞数为每视野的平均细胞数。

1.7上皮间质转化(EMT)形态学观察 取对数生长期各组细胞，将各组细胞置于倒置显微镜中以观察EMT形态的改变。

1.8Western印迹 取各组对数生长期C-33A细胞，加入200 μl含0.01 mol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液提取总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白质含量。取等量蛋白质样品，100℃变性5 min后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在4℃条件下加入Vimentin、Fibronectin(1∶1 000)并孵育过夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶10 000)室温下继续孵育2 h，TBST清洗3次，每次5 min，最后加入电化学发光(ECL)液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表达水平。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 10只雄性无特定病原体(SPF)级别Balb/c裸鼠，5周龄，体重(16±2)g购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0009。参照周慧等〔9〕方法，建立宫颈癌裸鼠移植瘤模型，取对数生长期C-33A细胞，调整细胞浓度为1×107，于裸鼠右侧腋窝处皮下注射0.2 ml细胞悬液。18 d后瘤体直径>0.5 cm为造模成功。将裸鼠随机分为2组：罗哌卡因0.0 mg/kg组和罗哌卡因0.3 mg/kg组〔10〕。分别灌胃给药罗哌卡因0.0、0.3 mg/kg每天1次，连续30 d。末次给药24 h后处死所有大鼠，称取肿瘤重量。取各组裸鼠肿瘤组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，切片厚度为5 μm。

1.10TUNEL染色 将裸鼠肿瘤组织切片用二甲苯浸洗2次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇脱水。用蛋白酶K工作液在37℃下封闭20 min，PBS清洗2次。在每个切片样本上加入50 μl TUNEL反应液，37℃避光孵育60 min。用DAPI复染10 min后于荧光显微镜下观察，随机选取5个视野，每个视野分别计数凋亡细胞数和细胞总数，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.11免疫组化 取各组裸鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋制成厚度约4 μm的切片，按免疫组化检测试剂盒说明书进行免疫组化染色，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒显色，苏木素复染，盐酸酒精分色。使用Image-Pro Plus6.0图像分析系统分析Vimentin阳性细胞占比，阳性细胞率=阳性细胞数目/总细胞计数×100%。

1.12统计学分析 使用GraphPad Prism5软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1罗哌卡因降低C-33A细胞细胞存活率 通过CCK-8法检测不同剂量罗哌卡因对C-33A细胞细胞存活率的影响，与0.010 mmol/L剂量〔(100.00±4.34)%〕比较，0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L剂量罗哌卡因细胞存活率显著降低〔(54.76±7.99)%、(30.03±6.07)%、(17.77±5.16)%、(9.31±8.25)%，均P<0.05〕，0.025、0.050、0.100、0.250 mmol/L剂量罗哌卡因细胞存活率无明显变化〔(99.11±5.13)%、(94.09±4.22)%、(90.78±5.67)%、(84.22±6.12)%，均P>0.05〕。通过计算得出罗哌卡因对C-33A细胞细胞存活率的IC50值为1.094。

2.2罗哌卡因降低C-33A细胞增殖EDU阳性细胞数 通过EDU染色检测各组细胞增殖结果如图1所示，与罗哌卡因0.00 mmol/L组〔(93.31±7.67)个〕相比较，罗哌卡因0.25 mmol/L组EDU阳性细胞数差异无统计学意义〔(88.22±9.35)个,P>0.05〕，罗哌卡因0.50、1.00 mmol/L组EDU阳性细胞数显著降低〔(34.13±6.73)个、(12.98±8.41)个，均P<0.05〕。

2.3罗哌卡因抑制C-33A细胞侵袭 通过Transwell检测各组细胞侵袭结果如图2所示，与罗哌卡因0.00 mmol/L组〔(116.31±17.13)个〕比较，罗哌卡因0.25 mmol/L组侵袭细胞数差异无统计学意义〔(107.96±12.65)个，P>0.05〕，罗哌卡因0.50、1.00 mmol/L组侵袭细胞数显著降低〔(39.77±14.18)个、(16.97±9.56)个，均P<0.05〕。

2.4罗哌卡因抑制C-33A细胞EMT，下调Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平 罗哌卡因0.00 mmol/L组较罗哌卡因0.50、1.00 mmol/L组细胞呈连接松散的类圆或纺锤体样，发生了典型的EMT，见图3。与罗哌卡因0.00 mmol/L组比较，罗哌卡因0.25 mmol/L组Vimentin、Fibronectin蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)，罗哌卡因0.50、1.00 mmol/L组Vimentin、Fibronectin蛋白水平显著降低(均P<0.05)。见图4，表1。

图1 各组细胞增殖(EDU染色，×200)

图2 Transwell检测各组细胞侵袭(结晶紫染色，×200)

图3 荧光显微镜下观测各组细胞上皮间质转化(×200)

1～4：罗哌卡因0.00 mmol/L组、罗哌卡因0.25 mmol/L组、罗哌卡因0.50 mmol/L组、罗哌卡因1.00 mmol/L组图4 Western印迹检测Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平

表1 罗哌卡因对C-33A细胞EMT和Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平的影响

2.5罗哌卡因对裸鼠移植瘤的影响 与罗哌卡因0.0 mg/kg组比较，罗哌卡因0.3 mg/kg组第25、30天肿瘤体积显著变小(P<0.05)；与罗哌卡因0.0 mg/kg组比较，罗哌卡因0.3 mg/kg组肿瘤重量显著降低、细胞凋亡率显著升高、Vimentin阳性细胞数显著降低(均P<0.05)。见图5、图6、表2、表3。

图5 罗哌卡因对裸鼠移植瘤的影响

图6 TUNEL染色检测细胞凋亡(×200)及免疫组化检测Vimentin阳性细胞数(×200)

表2 罗哌卡因对裸鼠移植瘤肿瘤体积的影响

表3 罗哌卡因对裸鼠移植瘤肿瘤重量、细胞凋亡率和Vimentin阳性细胞数的影响

3 讨 论

宫颈癌是妇科肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性生命健康〔11〕。既能有效镇痛又能抑制肿瘤细胞复发转移的药物是临床上麻醉与镇痛所追求的理想目标。罗哌卡因作为长效局麻药物，因毒性较低，起效快，在宫颈癌手术中的生物安全性已得到认可。本研究结果提示罗哌卡因可抑制宫颈癌裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长。

癌细胞过度增殖是宫颈癌病灶内重要的生物学特征，即抑制癌细胞增殖是治疗宫颈癌的必要方式。已有研究表明，局部麻醉药可抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡，避免全麻药物对机体免疫功能的损伤〔12〕。夏明等〔13〕研究发现罗哌卡因通过下调(TCF)-4和beta-catenin蛋白表达抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。Bundscherer等〔14〕研究发现高浓度的罗哌卡因对结肠癌细胞显示出抗增殖能力。本研究发现，罗哌卡因具有降低C-33A细胞EDU阳性细胞数的作用。提示罗哌卡因抑制C-33A细胞增殖。

侵袭是所有恶性肿瘤的特征性生物学行为，关系着疾病的发展和预后。尽管宫颈癌有相对成熟的手术、放疗和化疗治疗方案，但侵袭和转移仍是中晚期宫颈癌治疗失败的主要原因。Vogelaar等〔15〕研究发现罗哌卡因可抑制结肠癌细胞侵袭和迁移。Piegeler等〔16〕研究发现罗哌卡因通过阻断蛋白激酶B(Akt)和黏着斑激酶的激活来抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的肺腺癌细胞侵袭。本研究发现，罗哌卡因具有降低C-33A细胞侵袭细胞数的作用。提示罗哌卡因抑制C-33A细胞侵袭。

EMT是上皮表型细胞转变为间质表型细胞的过程，EMT通过与基底膜相互作用，使间充质细胞处于更多的运动状态，升高间充质细胞的迁移能力、侵袭性和提高对细胞凋亡的抗性〔17〕。已有研究表明EMT可促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭，进而促进肿瘤的转移，影响患者的预后〔18〕。EMT的主要特点是上皮细胞标志蛋白E-Cadherin表达的降低，和间充质细胞标志蛋白N-Cadherin及Vimentin表达的升高〔19〕。Fibronectin是间充质细胞标志物，为细胞外基质糖蛋白，对细胞黏附、迁移和生长具有重要的调控作用，在宫颈癌中表现为表达上调〔20〕。本研究发现，罗哌卡因具有下调C-33A细胞Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平和降低裸鼠移植瘤模型Vimentin阳性细胞数的作用。提示罗哌卡因抑制宫颈癌细胞EMT。