朱琏缓慢捻进法对衰老大鼠超氧化物歧化酶表达的影响

毛佳楠 罗伟 王莉灵 赵彩娇

(广西中医药大学针灸推拿学院，广西 南宁 530001)

衰老的机制众多，有自由基学说〔1,2〕、端粒学说〔3〕、细胞凋亡学说〔4,5〕等。其中，自由基学说是世界范围内被认可的主流学说。超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶的重要组成部分之一，它协同过氧化氢酶清除自由基。有研究发现针刺对衰老模型大鼠具有显著疗效，其延缓衰老机制与调节自由基代谢有着密切的关系〔6～9〕。朱琏缓慢捻进法是在针尖轻触皮肤后，进行捻转，同时稍加向下的压力，时而停时而捻，如此反复，将针捻入皮肤之后，继续缓慢捻转寻找针感，直到预定深度的一种进针法〔10〕。研究〔11～13〕表明普通针刺能够改善衰老相关指标水平的表达。对比普通针刺和朱琏缓慢捻进法，其差异主要在于进针的过程，而朱琏缓慢捻进法在衰老相关领域的实验研究较少，目前尚不清楚进针过程的差异对延缓衰老效果的影响。本研究以亚急性衰老模型大鼠为研究对象，探讨朱琏缓慢捻进法延缓衰老的机制，从预防和治疗两方面观察朱琏缓慢捻进法对衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝组织中 SOD mRNA相对表达量的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供的健康SD大鼠60只，雄性，体重240～280 g。动物合格证号：SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠饲养于温度23～25℃的实验室。实验开始前先适应性喂养14 d，整个饲养过程中大鼠自由摄食和饮水。适应性饲养结束后将所有大鼠按随机数字表法分成空白对照组、模型对照组、朱琏缓慢捻进法预防组、普通针刺预防组、朱琏缓慢捻进法治疗组、普通针刺治疗组，每组10只。饲养与实验全程对动物的处置符合国家科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2主要仪器及试剂 华佗牌“承臻”一次性使用无菌针灸针(规格0.25 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司)，BCD-216SDM冰箱(青岛海尔股份有限公司)，MT70-2微孔板恒温孵育器(杭州米欧仪器有限公司)，Epoch全波长酶标仪(美国Biotek公司)，CBFSTPRP-24全自动研磨器(上海测博生物科技发展中心)，QuantStudio 6实时荧光定量-聚合酶链的反应(PCR)仪(美国ABI公司)，HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，玻璃毛细管(华西医科大学仪器厂)，D-半乳糖(美国Sigma公司)，0.9%氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司)，SOD试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，15596-026总RNA抽提试剂(美国Ambion公司)，R101-01/02反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，AI101核糖核酸酶抑制剂(北京全式金生物技术有限公司)。

1.3大鼠亚急性衰老模型的建立 参考崔美芝等〔14〕造模方法，用0.9%氯化钠溶液将D-半乳糖配制成10%的D-半乳糖溶液，以腹腔注射的方式给药(500 mg/kg)，现配现用。大鼠每日空腹称体重，除空白对照组外，所有大鼠每天于9时腹腔注射D-半乳糖溶液。连续造模42 d出现竖毛拱背、毛色枯黄无光泽、畏寒肢冷、进食量减少、精神萎靡、行动迟缓等衰老征象，提示造模成功。

1.4治疗方法 参照赵彩娇等〔15〕治疗时程安排，预防组每日造模给药结束后进行治疗，共42 d；治疗组待整体实验造模结束后再治疗，共治疗28 d。朱琏缓慢捻进法预防组：给药完毕后将大鼠以仰卧位固定，进行预防治疗。参照《大鼠穴位图谱的研制》〔16〕，取“关元”、双侧“足三里”，采用朱琏缓慢捻进法，进针全程耗时2 min，留针30 min，中途用捻转补法行针1次，约1 min，每日1次，共42 d。普通针刺预防组：给药后，将大鼠以仰卧位固定，进行预防治疗，取“关元”、双侧“足三里”，常规针刺留针30 min，中途用捻转补法行针1次，约1 min，每日1次，腧穴定位、治疗时间同朱琏缓慢捻进法预防组。朱琏缓慢捻进法治疗组：造模成功次日开始进行治疗，取穴、腧穴定位及操作方法同朱琏缓慢捻进法预防组，共治疗28 d。普通针刺治疗组：造模成功次日开始进行治疗，取穴、腧穴定位及操作方法同普通针刺预防组，共治疗28 d。

1.5观察指标及方法 血清SOD活性的检测：各组大鼠于造模后和治疗结束后次日用玻璃毛细管进行眶底静脉丛采血1.5 ml，4 ℃过夜后，3 000 r/min离心15 min，取上清液进行检测。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。于酶标包被板上的标准孔中加样 50 μl，待测样品孔中先后加入样品稀释液和待测样品各40 μl和10 μl。封板后37℃温育30 min，弃去液体，甩干后加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。除空白孔外，每孔加入酶标试剂50 μl。封板后37℃温育30 min后弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。每孔先后加入各50 μl显色剂A、B轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。每孔加终止液 50 μl，使反应终止。在添加终止液之后的15 min内，空白孔调零，波长450 nm，测量各孔的吸光度(OD值)。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，计算出样品浓度后再乘以稀释倍数，即可得出样品的实际浓度。

SOD mRNA的检测：各组大鼠于治疗结束次日称重后用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,完成眶底静脉丛采血后处死，于冰台上快速取肝，剪碎100 mg肝组织立即浸泡RNA保存液，放入液氮贮存。使用实时荧光定量-PCR检测SOD mRNA的相对表达量。取新鲜冰冻组织，加入总RNA抽提试剂1 ml，研磨成浆，移至无RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min。加入氯仿200 μl，混匀，室温放置5 min。离心15 min(12 000 r/min，4℃)，可见分成上中下三相。转移上层水相于另一新1.5 ml EP管中，加入异丙醇400 μl，混匀，室温静置10 min后，离心10 min(12 000 r/min，4℃)，于管底可见白色的RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的75%乙醇1 ml，涡旋混匀后，离心5 min(10 000 r/min，4℃)。重复1次。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于20 μl 的DEPC水中。将RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA。cDNA做5倍稀释后进行扩增。扩增反应体系组成：各0.4 μl的上游引物和下游引物(委托北京擎科生物科技有限公司合成)，SOD1正义链：5′-GAGAGCATTCCATCATTG-3′，反义链：5′-GAGACTCAGACCACATAG-3′；SOD2正义链：5′-GGAGATGTTACAACTCAG-3′，反义链：5′-CTCCTTAAACTTCTCAAAAG-3′；SOD3正义链：5′-CTAGGAATCCTTCACACC-3′，反义链：5′-GAGCAAACTCAAAGACTG-3′。0.4 μl的50×ROX Reference Dye 2、10 μl的SYBR Green Master Mix、4.8 μl的ddH2O。扩增反应条件：预变性(95℃，10 min)；变性(95℃，30 s)，退火/延伸(60℃，30 s)，40个循环，最终延伸(50℃，2 min)。于荧光定量PCR仪上进行扩增反应，每个循环由电脑自动记录反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。采用双标准曲线法对数据进行相对定量分析。按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1朱琏缓慢捻进法和普通针刺对衰老模型大鼠血清中SOD活性的影响 造模结束后，与空白对照组相比，模型对照组血清中SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型对照组相比，两个预防组血清SOD活性显著上升(P<0.05)；两个治疗组血清中SOD活性相对模型组，差异无统计学意义(P>0.05)；预防组中使用朱琏缓慢捻进法的SOD活性更高(P<0.05)。治疗结束后，模型对照组血清SOD活性显著低于空白对照组(P<0.05)。预防组和治疗组血清中SOD活性较模型对照组均显著上升(P<0.05)；和朱琏缓慢捻进法预防组相比，普通针刺预防组的活性更低(P<0.05)；和朱琏缓慢捻进法治疗组相比，普通针刺治疗组的活性更低(P<0.05)；和朱琏缓慢捻进法治疗组相比，朱琏缓慢捻进法预防组活性更高(P<0.05)，和普通针刺治疗组相比，普通针刺预防组的活性更高(P<0.05)。见表1。

2.2朱琏缓慢捻进法和普通针刺对衰老模型大鼠肝组织中SOD基因表达的影响 实验结束后，模型对照组肝组织中SOD mRNA的相对表达量显著低于空白对照组(P<0.05)；预防组和治疗组的肝组织SOD mRNA的相对表达量显著高于模型对照组(P<0.05)；预防组和治疗组中，采用朱琏缓慢捻进法肝脏SOD mRNA相对表达量显著高于采用普通针刺法(P<0.05)；和朱琏缓慢捻进法治疗组相比，朱琏缓慢捻进法预防组SOD mRNA相对表达量更高(P<0.05)；和普通针刺治疗组相比，普通针刺预防组的SOD mRNA相对表达量更高(P<0.05)。见表1。

表1 造模后、治疗后各组血清SOD活性及治疗后肝组织SOD mRNA表达比较

3 讨 论

本研究结果说明，朱琏缓慢捻进法和普通针刺均可起到良好的防止血清SOD活性降低的作用；朱琏缓慢捻进法预防血清SOD活性降低的效果较普通针刺更明显；朱琏缓慢捻进法比普通针刺提高SOD活性的效果持久；朱琏缓慢捻进法和普通针刺均能有效提高亚急性衰老模型大鼠SOD的活性；朱琏缓慢捻进法提高SOD活性的效果优于普通针刺；使用朱琏缓慢捻进法对衰老进行预防性干预的效果优于治疗性干预；使用普通针刺对衰老进行预防性干预的效果优于治疗性干预，朱琏缓慢捻进法和普通针刺均能有效提高亚急性衰老模型大鼠SOD基因的表达；朱琏缓慢捻进法提高SOD mRNA相对表达量的效果优于普通针刺；使用朱琏缓慢捻进法对衰老进行预防性干预的效果优于治疗性干预；使用普通针刺对衰老进行预防性干预的效果优于治疗性干预。

自由基能与核酸反应，降解碱基，破坏氢键，使基因发生突变；自由基除了能氧化蛋白质，使多肽链断裂，还能抑制蛋白质合成；自由基还极易与胞膜内的不饱和脂肪酸反应，生成脂质自由基，对细胞的各种膜结构产生巨大的破坏〔2〕。以上种种共同导致了细胞组织的老化，从而产生了衰老。虽然机体的正常代谢能有效清除自由基，但抗氧化剂和自由基清除剂随着年龄的增长而减少，导致自由基水平升高，细胞和组织的结构功能受到不可逆的损伤，从而引起衰老。

SOD是一类广泛存在于动植物体内的抗氧化酶，能够催化代谢产生的超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧，过氧化氢则可在过氧化氢酶的作用下被分解成水和氧，从而清除体内的自由基，维持动态平衡。在动物体内，SOD主要分为存在于胞质和胞核中的Cu/Zn SOD(SOD1)、存在于线粒体中的Mn SOD(SOD2)和存在于细胞外的EcSOD(SOD3)。SOD从牛红细胞中分离提纯获得〔17〕，研究发现了SOD催化超氧阴离子发生歧化反应的特性〔18〕。研究表明SOD具有通过清除自由基来延缓衰老的作用〔19〕，亦有研究表明针刺能够通过改善SOD的表达，来延缓衰老〔20～24〕。本研究发现，朱琏缓慢捻进法和普通针刺均能有效提高亚急性衰老模型大鼠SOD活性和SOD基因表达，是对以往研究的印证。

朱琏缓慢捻进法是我国著名针灸学家朱琏先生提出的一种进针法。朱琏认为针灸治病的关键在于激发和调整机体内部神经系统的调节功能和管制功能〔25〕。根据调整神经系统的原理及现代神经生理学说的认识，发现针灸对机体进行刺激，产生的皮肤感觉，可能投射回大脑皮层上相对应的点，从而达到治疗目的〔25〕。朱琏缓慢捻进针法的基本操作步骤如下：①施针者在针尖尚未接触皮肤时要捏紧针柄，以防无菌的针掉落；②刺手靠近预定腧穴后使针尖轻轻接触皮肤，此时刺手手指稍微放松，进行缓慢地捻转，在停止捻转时捏紧针柄；③如此捻捻停停，停停捻捻，在捻转的同时稍稍施加压力，将针捻入；④捻入皮肤后继续捻转以寻找针感，直到预定的深度。施针者在操作全程中要保持注意力集中，刺手稳定，以防止偏离穴位或用力不当。朱琏将上述步骤总结成4句口诀：“指实心清紧执针，针尖刺穴近稳轻；肘平腕举手抬起，虚实交替捻入深”〔10〕。

祖国医学认为脏腑虚衰、阴阳失调、气血虚损等是造成衰老的几大原因。体表皮肤分布着大量的感觉神经末梢，作用于皮肤的刺激通过感受器转换成传入神经上的动作电位〔25〕，经脊神经反射性地调整大脑皮质功能，从而改善机体状态与功能。朱琏缓慢捻进法通过上述的操作，皮肤的末梢神经获得持续性刺激，产生皮肤感觉，通过浅感觉传导通路〔26〕投射至大脑皮层，维持并改变大脑皮层的兴奋状态〔25〕，并通过控制神经递质和自主神经〔25〕，从而激活、调动神经功能，使全身的经脉和脏腑都能接受到神经信号的刺激，各脏腑、经脉的功能慢慢恢复，继而气血充盛、阴阳调和，从而达到延缓衰老的作用。

此外，本研究选用了常规的保健穴“关元”和“足三里”。两穴一阴一阳，相辅相成，起到了补益气血，益肾固元，调整阴阳的作用。“关元”和“足三里”合用，能够抗自由基氧化，延缓衰老已在多项研究中被证实〔6，8，21,27～30〕。

综上，朱琏缓慢捻进法可以有效调整亚急性衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝组织中 SOD mRNA相对表达量，对衰老模型大鼠具有显著的防治作用，提示朱琏缓慢捻进法延缓衰老的机制可能与调节SOD代谢相关；使用朱琏缓慢捻进法和普通针刺对衰老进行预防性干预的效果优于治疗性干预；朱琏缓慢捻进法对衰老模型大鼠的防治作用优于普通针刺。