高效液相色谱法测定头孢曲松钠中2-巯基苯并噻唑含量

王喃喃 许鑫 刘姣 崔成伟

(山东鲁抗医药股份有限公司，济宁 272100)

头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)，属半合成的第三代头孢菌素，具有抗菌活性强、对细胞外膜和组织的穿透力强、有效血药浓度维持时间长、体内代谢稳定、血浆蛋白结合率低、可用于肝或肾功能不全者等特点[1-3]，被收录在世界卫生组织(WHO)基本药物标准清单及《国家基本药物目录(2018年版)》，是临床所需的最有效的药物。头孢曲松钠合成工艺为：7-氨基头孢烷酸(7-ACA)与三嗪环，在三氟化硼/乙腈的催化下，合成7-ACT后，由7-ACT和AE活性酯在单一的乙醇体系或者多元溶剂体系下进行反应生成一分子头孢曲松钠与2-巯基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole，MBT)，副产物MBT直接以固体形式分离后再加入成盐剂获得头孢曲松钠晶体。而MBT作为头孢曲松钠合成过程中的副产物，2016年，WHO国际癌症研究机构致癌物清单将其列为2A类致癌物，且有文献报道[4-5]，MBT可刺激皮肤和黏膜，能引起皮炎及难以治疗的皮肤溃疡，可致敏，但是目前尚未见头孢曲松钠中2-巯基苯并噻唑检测方法的相关报道。因此，为了更好地控制头孢曲松钠的质量，有必要提供一种测量方法，以检测头孢曲松钠中是否含有2-巯基苯并噻唑，从而保证用药的安全性。

1 仪器与材料

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；MSA6.6S-0CE型百万分之一天平(德国Sartorius公司)；AB265-S型十万分之一分析天平(美国Mettler Toledo公司)。

2-巯基苯并噻唑对照品(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PI2-MBT-20181030-01)；头孢曲松钠(山东鲁抗医药股份有限公司，批号：20181905045、2081905046、2081905047)；乙腈(新蓝景化学工业有限公司，批号：B2119011000)；甲酸(天津光复科技发展有限公司，批号：20131105)；纯化水(屈臣氏集团有限公司，批号：20181204)。所有试剂均为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)，等度洗脱；流速为0.5 mL/min；柱温为25℃；检测波长为320 nm；进样量20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液

精密称取2-巯基苯并噻唑对照品适量，加水-乙腈(60:40,V/V)使溶解并定量稀释制成每1 mL中约含2-巯基苯并噻唑0.1 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取头孢曲松钠适量，精密称定，加水-乙腈(60:40,V/V)溶解并定量稀释制成每1 mL中约含头孢曲松钠10 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 系统适用性溶液

取头孢曲松钠适量，精密称定，加2-巯基苯并噻唑对照品溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含头孢曲松钠10 mg的溶液，作为系统适用性溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下各溶液分别进样，系统适用性溶液典型色谱图见图1。空白溶剂不干扰样品测定，系统适用性溶液中2-巯基苯并噻唑与相邻峰之间分离度大于1.5，头孢曲松钠中其他特定杂质(脱酰头孢噻肟内酯、7-ACA、三嗪环、AE活性酯、7-ACT、E异构体)均在10 min之前出峰或者在该色谱条件下不出峰，不干扰样品测定。方法专属性良好。

2.4 定量限与检测限

将"2.2.1"项下2-巯基苯并噻唑对照品溶液以水-乙腈(60:40,V/V)为溶剂进行稀释，S/N≈10时的浓度作为定量限浓度，S/N≈3时的浓度作为检测限浓度。定量限浓度相当于样品浓度的百分比(%)为0.00005%(0.5 ppm)，检测限浓度相当于样品浓度的百分比(%)为0.000015%(0.15 ppm)。

2.5 线性与范围

在定量限～200%限度浓度范围内选取6个浓度点(定量限溶液、0.02、0.04、0.1、0.14和0.2 μg/mL)进行配液测定。精密量取系列线性溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以溶液浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归分析。2-巯基苯并噻唑在0.0051～0.2051 μg/mL浓度范围内，线性方程为y=6.4195x-0.0098，r=0.9996(＞0.999)。线性关系图见图2。

2.6 准确度试验

取2-巯基苯并噻唑对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并定量稀释制成约0.2 μg/mL的溶液作为杂质对照品储备液。分别取头孢曲松钠100 mg，精密称定，分置于9个10 mL量瓶中，分成3组，分别加入杂质对照品储备液4、5和6 mL，加入溶剂稀释定容至刻度，制成80%、100%、120% 3个浓度的准确度试验溶液。分别精密量取上述溶液各20 μL，进样测定，计算回收率，结果见表1。2-巯基苯并噻唑3个浓度9点回收率在86.3%～102.3%之间，平均回收率为102.8%，RSD=6.0%。

表1 2-巯基苯并噻唑方法学验证-准确度试验结果Tab.1 Method validation of MBT-accuracy tests

2.7 重复性与中间精密度试验

两位分析员在不同时间，用两台不同仪器试验，每位分析员分别配制6份加标供试品溶液和2份2-巯基苯并噻唑对照品溶液。配制方法见“2.2”项下对照品溶液与系统适用性溶液(加标供试品溶液)。取配制溶液各20 μL分别进样分析，计算6份样品中2-巯基苯并噻唑含量，结果见表2。6份样品中2-巯基苯并噻唑含量测定结果RSD≤2.0%，12份样品中2-巯基苯并噻唑含量测定结果RSD≤2.0%。

表2 2-巯基苯并噻唑方法学验证-重复性与中间精密度试验结果Tab.2 Method validation of MBT-precision tests

2.8 稳定性试验

取“2.2”项下对照品溶液与系统适用性溶液，分别置于0 h、室温与4℃条件下1、2、4、6、8和12 h后测定，考察对照品溶液与样品溶液的稳定性。结果为4℃条件12 h对照品溶液RSD为1.5%，系统适用性溶液RSD为1.9%；室温条件12 h对照品溶液RSD为6.5%，系统适用性溶液RSD为10.2%。表明对照品溶液与样品溶液在4℃条件12 h内稳定。

2.9 耐用性试验

分别对柱温、流速、色谱柱、流动相比例、甲酸比例等条件进行波动，结果见表3。改变柱温、流速、色谱柱、流动相比例、和甲酸比例，系统适用性溶液分离度均符合要求，表明实验条件的微小变化对2-巯基苯并噻唑含量测定无影响。

表3 2-巯基苯并噻唑方法学-耐用性试验结果Tab.3 Method validation of MBT-durability tests

2.10 样品测定

取3批头孢曲松钠样品，对其2-巯基苯并噻唑含量进行测定，结果见表4。3批样品中2-巯基苯并噻唑含量均低于定量限。

表4 头孢曲松钠中2-巯基苯并噻唑含量测定结果Tab.4 Determination results of MBT in ceftriaxone sodium

3 讨论

(1)《遗传毒性杂质控制指导原则》中MBT属于已知致癌物质，按照Ⅰ类杂质控制，Ⅰ类杂质控制限度按照PDE或者ADI进行控制。毒性数据库中检索2-巯基苯并噻唑大鼠口服的TD50为344 mg，本品最大日剂量为4 g，根据TD50和最大日剂量计算MBT人体可接受限度为84 ppm。根据EMA关于基因毒性杂质限度指南中TTC分段概念，接触时间≤1个月的允许日吸入量为60 μg，头孢曲松钠的最大日剂量为4 g，限度应为15 ppm。因此，制定内控标准为不得过10 ppm。

(2)采用水-乙腈(60:40,V/V)、0.1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、0.5%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、2.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)筛选流动相，结果采用1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)作为流动相时MBT的峰型最好，并通过调节流速为0.5 mL/min，使MBT与相邻峰达到基线分离，分离度良好。

(3)头孢曲松钠及USP41收载的各特定杂质(脱酰头孢噻肟内酯、7-ACA、三嗪环、AE活性酯、7-ACT、E异构体)在254 nm波长下有最大吸收，MBT在320 nm波长下有最大吸收，为了提高检测灵敏度以及方法专属性，实验选择320 nm作为检测波长。

(4)采用流动相1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)为稀释剂，MBT的提取回收率较低，分析原因MBT偏碱性，酸度系数(pKa)约为9.80，酸性条件下易于析出。采用水-乙腈(60:40,V/V)为稀释剂，2-巯基苯并噻唑3个浓度回收率在86.3%～102.3%之间，表明采用水-乙腈(60:40,V/V)能够将样品中MBT提取较为完全。