长链非编码RNA-p21 调控微小RNA-9/去乙酰化酶1 信号通路逆转结直肠癌细胞奥沙利铂耐药性

张丽菊 ，姜晓明 ，陈昌贤 ，吴 喜 ，张振勇 ，刘为军

（1）云南大学医学院，云南 昆明 650091；2）云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院肛肠科，云南 昆明 650032；3）昆明理工大学医学院，云南 昆明 650031）

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，到目前为止，在制定临床治疗方案时尚未能实现依据 CRC 的分子特征进行个体化治疗。药物治疗是CRC 目前主要的治疗手段。然而，耐药性的产生大大限制了其治疗效果。化疗药物奥沙利铂（oxalipl atin，OXA）属于第三代铂类化合物，已广泛用于进展期 CRC 的治疗。然而，在 CRC 化疗过程中，肿瘤药物抵抗影响了奥沙利铂对CRC 的治疗效果和预后，患者结局并不理想[1-2]。因此，改善奥沙利铂的化疗耐药对改善结直肠癌的预后具有重要的临床意义。

目前，有多种关于 CRC 细胞产生奥沙利铂耐药机制的研究，自噬是研究热点之一[3-4]。细胞自噬可通过多途径改善结直肠癌[5]等肿瘤细胞对奥沙利铂的化疗耐药。长链非编码 RNA（long non－coding RNA，lncRNA）是指长度在大于200nt 的转录本，它们不参与编码蛋白，却参与多种重要的生物学调控过程。LncRNA-p21 是一个长链基因间非编码 RNA，被认为是 p53 直接转录的靶基因[6]，在多种癌症中发挥重要作用，是一个有潜在价值的癌症治疗靶点[7]。有研究表明LncRNA-p21 与 miR-9 相互作用[8]，且 miR-9 能够影响细胞自噬过程[9]，但这一过程的具体机制并不十分明确。本研究拟在细胞水平探讨 CRC中LncRNA-p21 参与奥沙利铂影响细胞自噬的过程及可能机制，并进一步分析LncRNA-p21 调控微小RNA-9（micro RNA-9,miR-9)/去乙酰化酶1（SIRT1）信号通路对结直肠癌细胞奥沙利铂耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

研究时间为2017 年1 月至2019 年12 月。人结直肠癌细胞株HCT116、SW620 均购买自美国的典型菌种保藏中心公司。美国礼来公司采购LncRNA-p21 蛋白、miR-9 蛋白、SIRT1 蛋白。自美国皮卡斯生物技术购买核酸提取试剂盒和Western 试剂盒。自美国西格玛公司购买奥沙利铂抑制剂和自噬抑制剂3-MA（3-methyladenosine）。微管相关蛋白1 轻链3（LC3）I/II 抗体来自美国Novus 公司；p62 抗体来自美国圣克鲁斯生物技术。转染试剂 Lipofectamine 2000 购自美国Life Technologies 公司；自日本TaKaRa 公司购买逆转录试剂盒；自武汉华美生物工程有限公司购买CCK-8 试剂盒；自美国Hyclone 生物有限公司购买RPMI-1 640 培养基及胎牛血清。

1.2 细胞培养

将结直肠肿瘤细胞置入含10% 胎牛血清的RPMI-1 640 培养基中（含2 mmoL/L 谷氨酰胺，100 U/mL 链霉素，100 U/mL 青霉素），在恒温培养箱中（37℃、5% CO2）培养48～72 h。取对数生长期细胞用于实验，细胞均活力良好。

1.3 细胞转染

取对数生长期肿瘤细胞，细胞活力良好，用胰酶消化后接种到6 孔板中，观察细胞密度达60% 左右时，使用转染试剂 Lipofectamine 2000分别将对照组 shRNA（sh-NC）、敲降 LncRNAp21 的 siRNA（si-LncRNA-p21）对 CRC 细胞株SW620、HCT116 进行转染，实验严格按照操作说明和流程进行操作。

1.4 蛋白质印迹法（Western blotting）

将细胞培养皿置于冰上，裂解细胞使用放射免疫沉淀试验裂解液，收集细胞然后提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度使用BCA 法。按照20 µg/孔蛋白样品量，将蛋白依次加入到聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，待电泳结束后取目的蛋白条带转膜，用5%脱脂奶封闭，随后加入相应一抗（按1∶1 000比例配制），4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗（按1∶2 000 比例配制），放置室温孵育2 h，化学发光液显色用增强型化学发光试剂，凝胶成像仪上曝光显影。

1.5 细胞活性检测

用胰酶消化各组对数生长期的细胞并使用完全培养基将细胞密度稀释为 1×105/mL。使用96孔板接种细胞，接种量 0.1 mL/孔，每孔加入100 µL 完全培养基。分别在 24 h、48 h、72 h、96 h 后更换新鲜培养基。

采用 CCK-8 试剂盒检测细胞活性。检测时，每孔加入 20 µL CCK-8 试剂，孵育 2 h。然后使用ReadMax 酶标仪（波长450 nm）检测各孔细胞的吸光值。细胞增殖能力与吸光值成正相关。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

检测mRNA 水平用RT-qPCR 法。提取各组细胞中总RNA 使用TRIzol 试剂盒，紫外可见分光光度计检测各组细胞中总RNA 浓度，然后取1 µg RNA 样品逆转录制备cDNA。设置反应体系参照试剂盒说明书，进行RT-qPCR 检测各样本中SIRT1 表达，（正向引物：5′ -TATGGCAAAA GCGGACAAGG-3′，反向引物：5′ -CTTCGCAACA TCACCAATGGA-3′），以β-肌动蛋白（β-actin）为内参。采用2-ΔΔCt法进行定量。

1.7 克隆形成实验检测CRC 细胞的增值活力

将对数生长期的CRC 细胞用无钙镁离子平衡盐溶液洗涤 2 次，然后用 DMEM 培养液（含有10% 胎牛血清）将细胞密度调整至 1×106/L。在6 孔板中使用终浓度为 1.5 µg/mL 的 MBP 或 MBPHTA 刺激并培养细胞（每孔2 mL）。使用等体积培养液作为阴性对照。经37 ℃，5% CO2培养箱培养 2 周后，将细胞用 4% 多聚甲醛固定10 min，然后用 0.05% 结晶紫染色 30 min，去离子水缓慢冲洗至 6 孔板无杂色，放置室温干燥。显微镜下计数细胞克隆，细胞数大于50 计数为1 个克隆。每组蛋白设 3 个复孔，计算克隆形成率。公式：克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.8 统计学处理

应用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。用两样本t检验比较2 组计量资料的差异；采用简单相关性分析检测克隆形成实验中CRC 细胞对奥沙利铂的敏感性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA-p21 在奥沙利铂耐药的 CRC 细胞HCT116，SW620 中高表达

通过 qPCR 检测奥沙利铂耐药细胞 HCT116-res 和 SW620-res，与正常 HCT116 和SW620 中LncRNA-p21 表达情况，发现 LncRNA-p21 在奥沙利铂耐药细胞HCT116-res 和 SW620-res 中高表达（图1）。

图1 LncRNA-p21 在奥沙利铂耐药的 CRC 细胞HCT116，SW620 中高表达Fig.1 LncRNA-p21 was highly expressed in OXaliplatin resistant CRC cells HCT116 and SW620

2.2 敲降 LncRNA-p21 抑制细胞自噬，改善HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗抵抗

通过细胞转染的方式敲降 HCT116 细胞中LncRNA-p21，其敲降 效率通 过qPCR 检 测（图2A）。在敲降 LncRNA-p21 以及对照 HCT116细胞中检测自噬特异性分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，自噬底物 P62，发现 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表达上调（图2B），说明 LncRNA-p21 能够影响HCT116 细胞的自噬过程。为了进一步研究LncRNA-p21 对 HTC116 细胞化疗耐药的影响，将敲降 LncRNA-p21 的HCT116 细胞以及对照HCT116 细胞使用奥沙利铂处理后，检测克隆形成情况，发现敲降 LncRNA-p21 能够改善HCT116 对奥沙利铂的化疗抵抗（图2C）。

图2 敲降 LncRNA-p21 能够提高 HCT116 对奥沙利铂的化疗敏感性Fig.2 Knockdown lncrNA-P21 can increase the chemosensitivity of HCT116 to oxaliplatin.

2.3 敲降 LncRNA-p21 影响 miR-9 的表达

为了探究 LncRNA-p21 对 miR-9 的影响，通过qPCR 检测敲降 LncRNA-p21 的 HCT116 细胞中 miR-9 的表达情况，发现敲降LncRNA-p21能够上调 miR-9 的表达（图3A），说明 LncRNAp21 可能是通过 miR-9 参与 HCT116 细胞化疗敏感性调控。

图3 敲降 LncRNA-p21 影响 miR-9 的表达Fig.3 Knockdown of lncRNA-P21 affected the expression of Mir-9

2.4 过表达 miR-9 改善 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗抵抗

通过细胞转染的方式在 HCT116 细胞中过表达 miR-9，使用 qPCR 检测转染效率（图4A）。在过表达miR-9 的细胞中检测自噬特异性分子 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，自噬底物 P62，发现 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62 表达上调（图4B），说明 miR-9 参与 HCT116 细胞自噬过程的调控。此外，在过表达 miR-9 的 HCT116 细胞中使用奥沙利铂处理后检测克隆形成，发现过表达 miR-9 改善了HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗敏感性（图4C）。

图4 过表达 miR-9 的增强 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗敏感性Fig.4 Overexpression of miR-9 enhances the chemosensitivity of HCT116 cells to oxaliplatin

2.5 SIRT1 的表达受到 LncRNA-p21 和 miR-9的调控

SIRT1 作为一个重要的分子，不仅参与细胞自噬的调控，还能够受到 miR-9 的影响。为了验证 LncRNA-p21 和 miR-9 对 SIRT1 的影响，通过WB 分别检测 SIRT 在敲降 LncRNA-p21 和过表达miR-9 的 HCT116 细胞中的表达。结果表明，敲降 LncRNA-p21 或者过表达miR-9 能够抑制 miR-9 的表达（图5A～B）。

图5 SIRT1 的表达受到 LncRNA-p21 和 miR-9 的调控Fig.5 The expression of SIRT1 is regulated by lncRNAP21 and miR-9

3 讨论

结直肠癌严重威胁人类的健康，对其分子机制的深入研究是提高我们对疾病认识、攻克疾病的必然要求。奥沙利铂是CRC 患者化疗的一线用药，其应用显著改善了结直肠癌患者的总生存期和缓解率[10]。但 OXA 的作用机制目前仍未完全清楚。其基本机制为奥沙利铂在细胞核内与 DNA结合形成的 DNA 加合物，导致 DNA 链内、链间交联、双链断裂等损伤，进而导致细胞因 DNA的转录、复制阻断而诱发其凋亡[9,11]。自噬在肿瘤发生和治疗过程中起着双刃剑的作用 ADDIN EN.CITE[12]，细胞自噬水平是影响肿瘤细胞对奥沙利铂化疗抵抗的重要因素，可通过保护结直肠癌细胞干性增强结直肠癌细胞对奥沙利铂的化疗抵抗[5]。

大量相关研究表明，LncRNA 可通过多种途径调节细胞自噬，介导肿瘤耐药，促进结直肠肿瘤的进展[13-14]。本研究结果也表明，LncRNAp21 在奥沙利铂耐药的 CRC 细胞 HCT116，SW620 中高表达，而敲降 LncRNA-p21 可抑制细胞自噬，改善 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗抵抗。有研究发现，LncRNA-p21 通过抑制βcatenin 信号通路进而减缓结肠癌干细胞的Warburg 效应进程[15]。本研究进一步发现，敲降LncRNA-p21 影响 miR-9 的表达，而过表达 miR-9 可改善 HCT116 细胞对奥沙利铂的化疗抵抗。研究还发现SIRT1 的表达受到 LncRNA-p21 和miR-9 的调控。基于以上研究，笔者已经清楚，LncRNA-p21 在奥沙利铂耐药的结直肠肿瘤细胞中表达显著上调，抑制 LncRNA-p21 表达可以提高 CRC 对奥沙利铂的敏感性；在抑制 LncRNAp21 表达的 CRC 细胞中，miR-9 表达水平升高而SIRT1 表达降低，同时自噬特异性分子 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，自噬底物 P62 升高。因此笔者提出假说：LncRNA-p21 通过 miR-9 调控SIRT 的活性，进而影响 SIRT 介导的细胞自噬，最终调控 CRC 对OXA 的化疗抵抗性。本研究为在分子层面探讨肿瘤发生发展的机制提供了良好的启示，同时为耐药性结直肠癌的治疗提供新的标志物和靶点。对于是否有进一步肿瘤细胞内信号通路的激活以及 LncRNA-p21，miR-9 及SIRT1 的功能尚有待进一步研究，该假说尚需通过体内实验来证实。