三七多糖吸湿、保湿性能及体外抗氧化活性

伍晓萍 ，代玉玲 ，张 玲 ，王 红 ，邹 琼 ，王进吉 ，刘艳红 ，陈 彤

（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2）昆明医科大学第一附属医院老年科，云南 昆明 650032；3）云南省妇幼保健院药剂科，云南 昆明 650051）

三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.chen ex C.H.），又名参三七、田七等，为五加科多年生草本植物，是我国名贵中药材。三七中主要有效成分包括：三七多糖，三七皂苷、黄酮类、氨基酸、挥发油等[1]。据现有研究发现三七多糖具有调节免疫功能[2]、抗炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]等药理作用，刘平平等[8]发现从三七发酵液提取的三七多糖对DPPH 自由基、羟自由基等具有一定清除作用。现已有研究表明，天然多糖如：银耳多糖、山药多糖、灵芝多糖等具有良好的吸湿保湿性能，在日化产品中具有良好的应用前景[9]，而三七多糖是否具有吸湿、保湿的生物活性尚未见报道。

三七药渣是三七在工业中提取三七总皂苷后的废渣[10]，其中三七多糖、三七素等成分仍具有药用价值却不能得到有效利用。本课题组前期采用水提醇沉法，从工业三七药渣中提取三七粗多糖，通过DEAE Sepharose Fast Flow 成功分离出中性多糖和酸性多糖，已证实三七药渣中提取的三七多糖具有多种生理活性[11-12]，且具有良好的安全性[13]。本文拟在前期研究基础上，首次考察从药渣中提取的三七粗多糖及纯化后各组分是否具有吸湿、保湿及体外抗氧化活性，为三七多糖用于日化产品、保健食品、药品研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

三七药渣（云南三七科技提供）；D-无水葡萄糖对照品、D-半乳糖醛酸对照品、DPPH、ABTS（上海源叶生物）；甘油、抗坏血酸（VC）、七水合硫酸亚铁（广东光华科技）；海藻酸钠（上海易恩）；DEAE Sepharose Fast Flow 填 料（美 国GE Healthcare）；透析袋（合肥白鲨生物科技）；其余试剂均为国产分析级纯。

1.2 仪器与设备

BSA224S 万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；DK-98-II 水浴锅（天津市泰斯特）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣）；H1850 高速离心机（湖南湘仪）；SCIENTZ-10ND 冷冻干燥机（宁波新芝）；玻璃干燥器（四川蜀玻集团）；岛津UV-1900 紫外-分光光度计（日本岛津）；Bio-rad MODEL 680 酶标仪（美国Bio-rad 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 三七多糖的提取、纯化及含量测定采用水提醇沉法从工业三七药渣中提取CPPN，取干燥三七药渣1 000 g，加入10 倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤；滤渣加入8 倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤；滤渣继续加入6 倍量超纯水，沸水浴提取6 h，过滤。合并3 次滤液，8 000 r/min 离心5 min，取上清液，80℃减压浓缩，至原体积的1/10 后，加入滤液3 倍体积的无水乙醇，放4 ℃下醇沉过夜。8 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，收集沉淀。分别用无水乙醇、乙醚洗涤沉淀三次后加入适量超纯水复溶，冷冻干燥，即得CPPN。采用DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换填料对CPPN 进行纯化，取CPPN 600 mg，溶于20 mL 超纯水中，8 000 r/min 离心10 min 去除不溶物，经0.45 µm 微孔滤膜过滤后上样，以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl 溶液对其进行梯度洗脱，收集洗脱液，5 mL/管。硫酸蒽酮法跟踪检测，绘制洗脱曲线其中管数为横坐标，吸光度值为纵坐标。依据洗脱曲线，合并各组分，80℃减压浓缩至原体积1/10，超纯水透析36 h（MwCO 14000Da），每4 h 换一次水。透析结束后，真空冷冻干燥，分离得到的各组分依次命名为NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ。采用硫酸蒽酮法，测定三七多糖中性糖含量，间羟基联苯法测定三七多糖糖醛酸含量[14]。

1.3.2 吸湿/保湿能力考察参照蔡婉静等[15]在研究中采用的方法，以常用的保湿剂甘油和海藻酸钠对照，考察CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿能力。（1）吸湿 性。准确称 取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g 于称量瓶中，平行3 份，将其放入置有饱和碳酸钾溶液（RH43%）和饱和硫酸铵溶液（RH81%）的干燥器内，室温下放置，并在4、8、12、24、36 h 分别称量样品放置前重量（W0）和放置后的重量（W1），吸湿能力按照公式（1）计算：

（2）保湿性。准确称 取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g 于称量瓶中，平行3 份，并分别加入3 倍样品质量的超纯水，转动称量瓶直至样品将水分完全吸收。将称量瓶放入装有干燥完全的硅胶的干燥室内，于室温下放置，并在4、8、12、24、36 h 分别称量样品放置前重量（H0）和放置后的重量（H1）。保湿能力按照公式（2）计算:

1.3.3 抗氧化能力测定（1）DPPH 自由基清除能力。将维生素C 和三七多糖各待测组分用蒸馏水配置成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL 浓度的样液测定时，在96 孔板中加入2×10-4mol/L的DPPH 乙醇溶液100 µL，然后加入100 µL 待测液，摇匀后，在室温，黑暗处放置30 min，并测定517 nm 处的吸光度值At，用乙醇代替DPPH溶液测定本底吸光度值Ar，用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0[16]。采用Vc 作为阳性对照，同一测定设计3 个平行，清除率按公式（3）计算:

（2）ABTS+自由基清除能力。将5 mL 的7 mmol/L ABTS 和88 µL 的140 mmol/L K2S2O8混 合，常温避光条件下静置过夜（12 h），形成ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇稀释成在734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02 工作液[17]。测定时，在96 孔板中加入ABTS+工作液100 µL 和100 µL待测液，振荡混匀，10 min 后测定反应液在734 nm处的吸光值At，用乙醇代替ABTS+工作液测定本底吸光度值Ar，用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0。采用Vc 作为阳性对照，同一测定设计3 个平行，清除率由公式（4）计算：

（3）羟基自由基清除能力。配置2.25 mmol/LFeSO4水溶液、9 mmol/L 水杨酸乙醇溶液，分别取50 µL 加入96 孔板，取50 µL 待测液加入，再加入50 µL 8.80 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反应30 min，测定510 nm 处吸光度At。用超纯水代替H2O2测得对应待测溶液的本底吸光度值Ar，用超纯水代替待测液测得参比溶液吸光度A0[18]。采用Vc 作为阳性对照，同一测定设计3 个平行，清除率由公式（5）计算：

2 结果

2.1 三七多糖的提取、纯化及含量测定

1 000 g 三七药渣采用经水提醇沉法，共提取到34.97g CPPN，得率为3.49 %。采用DEAE Sepharose Fast Flow 对CPPN 进行纯化，以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl 溶液洗脱，共得到4 个洗脱峰（洗脱曲线见图1），得率分别为27.68%、11.89%、15.41%、21.04%，对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的含量测定结果如表1 所示。

表1 三七多糖的含量测定结果（%）Tab.1 Determined the contents of Panax notoginseng polysaccharide（%）

图1 DEAE Sepharose Fast Flow 洗脱曲线Fig.1 Elution curve with DEAE Sepharose Fast Flow

2.2 三七多糖的吸湿性

在RH43% 环境中，水分的含量随时间的变化结果如图2 所示，三七多糖及各组分的吸湿率均逐渐上升，吸湿率大小依次为甘油＞APPNⅢ＞海藻酸钠＞CPPN＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞NPPN，36 h 时，吸湿率分别为37.21%、25.50%、23.55%、19.10%、18.43%、16.99%、13.20%。从图3 可以看出，在高湿度（RH81%）环境中，在0～12 h，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿率上升较快，12 h～36 h 变化缓慢，36 h 时，吸湿率大小为甘油＞APPNⅢ＞海藻酸钠＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞CPPN＞NPPN，吸湿率大小依次为83.57%、42.58%、39.76%、30.81%、27.80%、24.59%、20.80%。由两图对比显示，APPNⅢ在高湿度和低湿度下都具有良好的吸湿性，其吸湿性高于海藻酸钠。

图2 三七多糖在RH43%环境中的吸湿率变化情况Fig.2 Relationship between moisture retention rate and time

图3 三七多糖在RH81%环境中的吸湿率变化情况Fig.3 Relationship between moisture retention rate and time

2.3 三七多糖的保湿性

保湿性考察实验结果如图4，在干燥硅胶环境中，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠保湿率均持续下降，保湿率大小依次为APPNⅢ＞海藻酸钠＞CPPN＞APPNⅡ＞甘油＞APPNⅠ＞NPPN，在36 h 时，保湿率分别为45.64%、40.35%、38.40%、36.15%、35.38%、34.35%、33.59%。

图4 三七多糖在干硅胶环境中的保湿率变化情况Fig.4 Relationship between moisture retention rate and time

2.4 三七多糖对DPPH 的清除能力

由图5可知，CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对DPPH 均具有较好的清除能力，且呈明显的量效关系，当多糖浓度为8 mg/mL 时，CPPN 对DPPH 自由基的清除效果最好，达58.36%，而NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除 率分别 为12.90%、50.66%、37.26%、47.71%。抗氧化活性顺序为CPPN＞APPNⅠ＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞NPPN。艾于杰等[18]发现纯化后的茶多糖清除DPPH 清除能力纯化前强于纯化后，推测粗多糖对DPPH 的清除作用可能为各组分结合后协同作用。本研究中三七粗多糖清除效果最好，推测其原因为七粗多糖中各组分协同发挥抗氧化作用。

图5 三七多糖对DPPH 的清除能力Fig.5 Scavening rate of DPPH of Panax notoginseng polysaccharide

2.5 三七多糖对ABTS+的清除能力

ABTS 可被活性氧氧化，生成蓝绿色的ABTS+自由基，在734 nm 处有特征吸收，当抗氧化剂存在时，自由基被抗氧化剂清除时，蓝绿色会逐渐褪色或消失[19]。三七多糖及纯化后各组分对ABTS+的清除效果图6 所示，随着多糖浓度的增大，其清除ABTS+自由基的效果也不断增强。当多糖浓度为8 mg/mL 时，CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分别为95.91%、36.41%、87.37%、68.34%、83.34%，抗氧化活性顺序为CPPN＞APPNⅠ＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞NPPN。三七粗多糖对ABTS+自由基的清除效果最好，分离纯化得到的4 个组分中，APPNⅠ的清除效果较强，NPPN 的清除能力较弱。有研究表明，多糖对ABTS+自由基的清除能力与DPPH 自由基的清除能力具有一致性[20]，本研究中CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对ABTS+的清除能力与对DPPH 自由基清除能力趋势一致。

图6 三七多糖对ABTS+的清除能力Fig.6 Scavening rate of ABTS+ of Panax notoginseng polysaccharide

2.6 三七多糖对羟基自由基的清除能力

羟基自由基是机体内攻击性最强的活性氧，多糖是具有多羟基的醛或多羟基的酮，该结构上带有还原性的半缩醛羟基，使自由基被还原，从而阻止自由基进行连锁反应[21]。由图7 可知，各浓度的VC 对羟自由基的清除率最高，不同浓度的CPPN 及纯化后各组分对羟自由基均具有一定的清除作用，随多糖浓度的升高，对羟自由基的清除能力也不断升高，当CPPN 浓度为8 mg/mL，CPPN 的清除能力为98.95%，与VC 接近。同一浓度下，抗氧化活性顺序为CPPN＞APPNⅢ＞APPNⅡ＞APPNⅠ＞NPPN。

图7 三七多糖对·OH 的清除能力Fig.7 Scavening rate of ·OH of Panax notoginseng polysaccharide

3 讨论

本文采用水提醇沉法成功从三七药渣中提取出三七多糖，并经过DEAE Sepharose Fast Flow 对其纯化，成功分离出NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ，并对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿性能首次初步探究，发现APPNⅢ的吸湿性能优于海藻酸钠，其保湿性能也优于海藻酸钠及常用保湿剂甘油，表明APPNⅢ是一种优良的保湿剂。

自由基，是生物体新陈代谢的正常产物，在正常的生理状态下，人体内自由基的产生处于动态平衡中，受体内各种内源性抗氧化网络的严格调控。当机体平衡一旦被打破，体内自由基过多时，自由基会引发氧化应激损伤，诱导各种疾病的发生和发展，如炎症、肿瘤等疾病。现有研究表明，诸多植物多糖具有抗氧化活性，如：枸杞多糖[22]、茯苓多糖[23]。多糖的抗氧化活性常与多糖分子量、糖基组成、糖苷键类型、高级结构等相关[18]。三七多糖体外抗氧化活性研究显示：三七粗多糖与分离纯化后的各组分比较，其对三种自由基的清除效果最佳，抗氧化能力最强，推测三七粗多糖中各组分多糖的抗氧化性有协同作用；纯化后的三种酸性多糖的抗氧化活性均强于中性多糖，说明三七多糖的抗氧化性与其酸性基团密切相关。综上，通对三七多糖具有吸湿、保湿性能及体外抗氧化活性，表明三七多糖具有应用于日化行业、保健食品、药品的潜力，为工业三七药渣的综合利用提供了新思路，有利于三七资源的综合利用。