福林酚分光光度法测定蜂毒中总蛋白质

苗会娟，胡卫国，徐艳梅，郝丽娟，高燕霞

(1.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050011； 2.华北制药股份有限公司，石家庄 050200； 3.天津大学化工学院，天津 300350)

蜂毒是意大利蜂用电刺激方法采集的毒腺分泌物，经过醇沉、萃取等工艺，提取而制得的冻干粉末，是一种成分复杂的混合物，主要包括肽类、酶类、生物胺、有机酸、矿物质等[1-4]，其中蜂毒肽约占蜂毒干重的50%，是其最主要的成分[5]。蜂毒具有祛风除湿的功效，可用于治疗关节疼痛、肢体沉重，急性风湿病、风湿性关节炎等症候[6-8]，同时还可以增强人体免疫力，是一种潜在的新冠肺炎治疗药物。

由于蜂毒结构复杂，影响药物稳定性的成分较多[9]，而总蛋白质量的变化在一定程度上可以反映药物的稳定性。准确测定蜂毒中总蛋白质含量一方面可以作为质量控制的目标和手段，另一方面可以提高用药的科学性和精准性，因此建立规范科学的方法测定蜂毒中总蛋白质含量具有重要意义。现行蜂毒标准收载于国家药品标准化学药品地标升国标第十六册，标准号为WS1-XG-016—2001。该标准中总蛋白含量采用双缩脲法测定，但该方法在配制对照品溶液和样品溶液时所用的溶剂不同，前者采用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，后者则采用纯水配制，测定波长设定为660 nm，而不是蛋白质-钼-钨复合物的最大吸收波长750 nm 或者650 nm[10]，影响测定结果的准确性。现有文献多对蜂毒中某一种或者某一类特定组分，如蜂毒肽[5]、蜂毒明肽[11]、磷脂酶A2[12]含量等进行测定。例如采用高效液相色谱法结合荧光检测器对蜂毒中蜂毒肽类的含量进行测定[13]，但该方法存在定量限较高、准确度和精密度较差，且抗干扰能力差等缺点。随着液相色谱-质谱(LC-MS)技术的发展与普及，LC-MS 法在各种基质中蜂毒肽的定量中均有应用[14-16]。然而LC-MS 法离子化效率不高，导致灵敏度较低[13-14]。

《中国药典》2020 年版[17]通则0731 中共收录了紫外-可见分光光度法、凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、考马斯亮蓝染色法及2，2′-联喹啉-4，4′-二羧酸法(BCA 法) 6 种测定蛋白质含量的方法。其中紫外-可见分光光度法只适用于蛋白质的初步筛查；凯氏定氮法和双缩脲法灵敏度低，且无机含氮化合物干扰测定结果。因为蜂毒略偏碱性，考马斯亮蓝法和BCA 法不适用于测定蜂毒中蛋白质含量。蛋白质中含有酚基的氨基酸残基(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，在碱性条件下能够将福林试液中的六价钨还原成五价钨，而使溶液显蓝色，并且溶液颜色的深浅与溶液浓度成正比，因此福林酚法广泛应用于酚类及蛋白质含量的测定[18-20]。但通则中的碱性铜溶液未加入二硫苏糖醇，测定波长未选用反应产物的最大吸收波长，同样影响测定结果的准确性。笔者在此基础上对测定波长和反应时间进行了优化，建立了福林酚法测定蜂毒中总蛋白质含量的方法。该方法操作简单，准确度及精密度良好，可为蜂毒的生产、质量控制和临床用药提供实验依据，同时为蜂毒标准的制定提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

紫外-可见分光光度仪：UV2600 型，日本岛津公司。

移液枪：1 mL、5 mL，A 级，美国Eppendorf 公司。

电子天平：XS105 型，感应量为0.01 mg，美国梅特勒-托利多公司。

蜂毒样品：批号分别为FD20211101、FD20211102、FD20211103，华北制药华坤河北生物技术有限公司。

血清白蛋白(牛)对照品：22.2 mg/支，批号为140619-202125，中国食品药品检定研究院。

福林酚贮备液：酸浓度为1 mol/L，批号为210807，北京索莱宝科技有限公司。

碳酸钠、酒石酸、硫酸铜、氢氧化钠：均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

实验用水为纯化水。

1.2 溶液配制

碱性铜溶液：称取氢氧化钠10 g、碳酸钠50 g，加入400 mL水溶解，作为甲溶液；称取酒石酸0.5 g，加入50 mL 水溶解，另称取硫酸铜0.25 g，加入30 mL 水溶解，将两溶液混合作为乙溶液。临用前，合并甲、乙溶液，并加水定容至500 mL。

福林酚溶液：酸浓度为0.125 mol/L，移取福林酚贮备液12.5 mL，加水稀释至100 mL，混匀。

血清白蛋白(牛)对照品溶液：222 μg/mL，取血清白蛋白(牛)对照品1 支，加水约1 mL 溶解，将溶液转移至100 mL 容量瓶中，用水多次洗涤西林瓶，洗液并入同一容量瓶中，加水稀释至标线，混匀。

血清白蛋白(牛)系列对照品溶液：用水将血清白蛋白(牛)对照品溶液逐级稀释成蛋白质的质量浓度分别为44、88、132、176、220 μg/mL 的系列对照品溶液。

蜂毒样品溶液：200 μg/mL，精密称取蜂毒样品约0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至标线，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加水稀释至标线，摇匀。

1.3 测定方法

精密量取血清白蛋白(牛)系列对照品溶液各1 mL，分别置于具塞试管中，分别精密加入碱性铜溶液1 mL，摇匀，于室温下放置10 min，然后分别精密加入福林酚溶液4 mL，立即混匀，于25 ℃下反应40 min，在750 nm 波长处测定溶液的吸光度。以蛋白质的质量浓度为自变量、以相应的吸光度为因变量进行线性回归，计算线性方程和相关系数。另精密量取0.5 mL 蜂毒样品溶液和0.5 mL 水，置于具塞试管中，同法测定。利用线性方程计算蜂毒样品溶液中蛋白质的质量浓度，根据称样量、定容体积和稀释倍数换算成样品中的含量，以质量分数表示。以水代替对照品溶液作为空白，同法测定。

2 结果与讨论

2.1 溶剂选择

蜂毒样品和血清白蛋白(牛)对照品均易溶于水，故选择纯水作为溶剂。

2.2 检测波长选择

分别取血清白蛋白(牛)对照品溶液和蜂毒样品溶液，按照1.3 方法进行反应，于490～900 nm 可见光波长范围内进行扫描，吸收光谱如图1 所示。由图1 可以看出，血清白蛋白(牛)对照品溶液和蜂毒样品溶液均在750 nm 处有最大吸收，因此选择检测波长为750 nm。

图1 血清白蛋白(牛)对照品溶液和蜂毒样品溶液吸收光谱图

2.3 样品溶液质量浓度选择

取蜂毒样品(批号为FD20211101)，按照1.2 方法配制5 种质量浓度的样品溶液，按照1.3 方法分别进行测定，结果见表1。由表1 可知，随着样品溶液质量浓度的增加，总蛋白质含量测定值基本不变，表明样品的质量浓度在线性范围内时，测量结果具有良好的重复性。但测定结果的相对标准偏差随着溶液质量浓度的增加呈现先降低后基本稳定的趋势。当样品溶液质量浓度为200 μg/mL，即参加反应的样品溶液质量浓度为100 μg/mL 时，RSD 趋于稳定，因此选择样品溶液质量浓度为200 μg/mL。

表1 样品溶液不同质量浓度时的测定结果

2.4 福林酚溶液用量选择

取蜂毒样品溶液5 份，各加入碱性铜溶液1 mL，然后分别加入福林酚溶液1.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按照1.3 方法测定溶液的吸光度，结果如图2所示。由图2 可以看出，当福林酚溶液加入量为4.0～6.0 mL 时，吸光度趋于平稳，故选择福林酚溶液用量为4.0 mL。

图2 不同福林酚溶液用量的吸光度

2.5 碱性铜溶液用量选择

取蜂毒样品溶液5 份，分别加入碱性铜溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，然后各加入福林酚溶液4.0 mL，按照1.3 方法测定溶液的吸光度，结果如图3所示。由图3 可以看出，当碱性铜溶液加入量为1.0 mL 时，吸光度最大。较大的吸光度数值有利于提高测定结果的灵敏度和准确性，因此选择碱性铜溶液用量为1.0 mL。

图3 不同碱性铜溶液用量的吸光度

2.6 反应温度选择

取蜂毒样品溶液，按照1.3 方法，设定反应时间为40 min，分别考察反应温度为25、40、55 ℃时的测定结果，结果表明，3 种反应温度条件下总蛋白质质量分数的测定值分别为94.5%、94.2%和94.6%，没有统计学上的差别。相比之下25 ℃时操作更加简单、便捷，故选择反应温度为25 ℃。

2.7 反应时间选择

取蜂毒样品溶液，按照1.3 方法，设定反应温度为25 ℃，分别考察反应时间为20、30、40、50、60 min时的测定结果，不同反应时间时的吸光度如图4 所示。由图4 可以看出，随着反应时间的延长，吸光度逐渐增大，当反应时间达到40 min 时，吸光度达到最大值并趋于稳定，因此选择反应时间为40 min。

图4 不同反应时间的吸光度

2.8 线性方程与定量限

取血清白蛋白(牛)系列对照品溶液，按照1.3方法分别进行测定，以蛋白质的质量浓度为自变量(x)、以相应的吸光度为因变量(y)进行线性回归，计算得线性方程为y=3.078 8x+0.025 7，相关系数为0.999 0，质量浓度线性范围为44.4～222.0 μg/mL。

按照1.3 方法，对空白溶液连续测定11 次，根据标准偏差和线性方程的斜率[21]，计算方法定量限为4.6 μg/mL。

2.9 精密度试验

称取蜂毒样品(批号为FD20211103) 0.107 5、0.111 0、0.114 2、0.113 6、0.107 2、0.113 3 g，分别置于100 mL 容量瓶中，按1.2 方法配制样品溶液，按照1.3 方法分别进行测定，结果见表2。由表2 可知，测定结果的相对标准偏差为1.6%，表明该方法具有良好的精密度，满足测定要求。

表2 精密度试验结果

2.10 加标回收试验

平行移取3 份蜂毒样品溶液，各0.25 mL，分别精密加入血清白蛋白(牛)对照品溶液0.15、0.25、0.35 mL，按1.3 方法每份样品测定3 次，结果见表3。由表3 可知，低、中和高3 种加标水平的回收率分别为104.53%、100.46%和96.56%，表明该方法具有良好的准确度。

表3 加标回收试验结果

3 结语

建立了福林酚分光光度法测定蜂毒中总蛋白质的方法，并考察了该法的精密度、准确度、回收率和定量限。结果表明，各技术参数均满足检测要求，建立的方法科学可行，可为蜂毒的质量控制提供技术依据。