柱前衍生气相色谱法测定氯乙酰氯中二氯乙酰氯

闫元春，冯云霞，马丹

(郑州原理生物科技有限公司，郑州 450000)

氯乙酰氯是一种重要的化学合成中间体，可以合成一系列医药化工产品[1-4]。氯乙酰氯及其同系物具有基因毒性[5-9]。笔者以氯乙酰氯合成盐酸利多卡因过程作为研究对象，跟踪检测氯乙酰氯中相关杂质的传递情况。氯乙酰氯中可能存在的杂质主要有氯乙酸、二氯乙酰氯、三氯乙酰氯等，多批样品分析结果表明，二氯乙酰氯是其中的主要杂质成分，乙酰氯和三氯乙酰氯的含量极低，同时跟踪检测氯乙酰氯与2，6-二甲基苯胺反应产物中的杂质情况及后续反应产物中的杂质情况，发现只需检测并控制氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量不超标，即可以确保其它微量杂质的含量符合要求，因此测定氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量具有重要意义。

文献[9-14]报道的检测方法主要集中在氯乙酰氯的检测，仅有文献[14]报道了氯乙酰氯中二氯乙酰氯的测定，但该方法存在出峰时间长，单个样品需耗时120 min；产生大量的废液；衍生样品直接进样，对色谱柱存在较大的损伤；采用末端吸收210 nm 进行检测，色谱峰干扰大等缺点，因此寻找一种能准确定量、检测时间短、色谱峰干扰小且对色谱柱损伤小的检测方法十分必要。

根据氯乙酰氯生产工艺及跟踪检测多批次二氯乙酰氯的衍生杂质，发现当氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量低于0.8%(质量分数)时，可保证终产品盐酸利多卡因原料药中二氯乙酰氯的衍生基因毒性杂质2，2-二氯-N-(2，6-二甲基苯基)乙酰胺的含量低于0.024%。笔者根据氯乙酰氯易成酯的特性，先采用正丁醇对氯乙酰氯及其中的杂质二氯乙酰氯进行衍生，生成氯乙酸正丁酯和二氯乙酸正丁酯，然后对对衍生化反应后的溶液用氢氧化钠溶液进行滴定中和，并对衍生时间、衍生温度、取样体积和衍生后的样品溶液放置时间等参数进行优化，建立了柱前衍生气相色谱法测定氯乙酰氯中二氯乙酰氯的方法。该方法提高了检测效率，降低了检测能耗，可对氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量进行准确测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：Agilent 7890B 型，配有氢火焰离子化(FID)检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：MS 105 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)国际贸易有限公司。

恒温水浴锅：HH-ZK4 型，河南佰泽仪器有限公司。

正丁醇：分析纯，天津化学试剂一厂。

氢氧化钠：分析纯，西陇科学股份有限公司。

百里香酚酞：指示剂，国药集团化学试剂有限公司。

无水乙醇：分析纯，西陇科学股份有限公司。

二氯乙酸正丁酯对照品：纯度为99%(质量分数)，批号为20200803B1-1，郑州原理生物科技有限公司。

氯乙酸正丁酯对照品：分析纯，纯度为97%(质量分数)，批号为P1034352，上海阿达玛斯试剂有限公司[15]。

氯乙酰氯样品：批号为20191204，宁夏荣泰生物科技有限公司。

高纯氮气：纯度为99.999%(体积分数)，河南科益气体股份有限公司。

1.2 溶液的配制

空白溶液：取50 mL 锥形瓶，加入5.0 mL 正丁醇，在60 ℃水浴中加热30 min，冷却后加入百里香酚酞指示剂2 滴，用1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定至溶液呈蓝色，静置分层，取上层溶液，作为空白溶液。

样品溶液：取50 mL 锥形瓶，加入4.2 mL 正丁醇，然后加入氯乙酰氯样品0.8 mL(约1.0 g)，在60℃水浴中加热30 min，冷却后加入百里香酚酞指示剂2 滴，用1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定至溶液呈蓝色，静置分层，取上层溶液，作为样品溶液。

二氯乙酰氯对照品溶液：40 mg/mL，取二氯乙酸正丁酯(二氯乙酰氯衍生物)对照品约1 000 mg，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀释并定容至标线，摇匀。

二氯乙酰氯系列标准工作溶液：移取二氯乙酰氯对照品溶液2、3、4、5、6 mL，分别置于5 只100 mL 容量瓶中，用正丁醇稀释并定容至标线，配制成质量浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL 的系列标准工作溶液。

氯乙酰氯对照品溶液：40 mg/mL，取氯乙酸正丁酯(氯乙酰氯衍生物)对照品1 000 mg，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀释并定容至标线，摇匀。

二氯乙酰氯、氯乙酰氯混合对照品溶液：质量浓度均为1.6 mg/mL，分别精密量取上述二氯乙酰氯对照品溶液、氯乙酰氯对照品溶液各1 mL，置于同一只25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀释并定容至标线，摇匀。

1.3 色谱条件

色谱柱：SE-30 型毛细管柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm，兰州中科安泰分析科技有限公司)；载气：高纯氮气；进样口温度：200 ℃；进样方式：分流进样，分流比为40∶1；柱箱升温程序：初始温度为170 ℃，保持5 min，以20 ℃/min 速率升温至200 ℃，保持10 min；检测器温度：250 ℃；进样体积：0.2 μL。

2 结果与讨论

2.1 衍生化反应条件选择

2.1.1 反应时间和温度

设定反应温度分别为55、60、65 ℃，反应时间分别为10、20、30、40 min，按1.2 方法配制样品溶液并进行衍生化处理，测定不同样品中二氯乙酸正丁酯的含量。以最终确定方法测定的样品中二氯乙酸正丁酯的色谱峰面积值为参照，将各条件下测定的二氯乙酸正丁酯的色谱峰面积与参照色谱峰面积进行比较，得到不同条件下二氯乙酰氯的回收率，结果见表1。由表1 可知，衍生化温度对二氯乙酰氯的回收率无显著影响，反应时间对二氯乙酰氯的回收率影响较大。在反应时间达到30 min 后，二氯乙酰氯的回收率均大于98.0%，故选择在60 ℃下衍生30 min 作为衍生条件。

表1 不同反应时间和反应温度时的回收率

2.1.2 取样体积和样品溶液放置时间

分别取0.4、0.6、0.8、1.0 mL 样品，加入适量正丁醇，使总体积为5 mL，置于60 ℃水浴中，按1.2方法，每种浓度水平平行配制3 份样品溶液并进行衍生化处理，在1.3 色谱条件下测定，计算测定结果的相对标准偏差。结果表明，当取样体积为0.4、0.6 mL 时，测定结果的相对标准偏差均大于10%；当取样体积为0.8、1.0 mL 时，测定结果的相对标准偏差均小于5%。综合考虑测定结果的重复性和色谱柱的耐受性，最终选择取样体积为0.8 mL(约1.0 g)。

按照1.2 方法配制样品溶液，分别于配制完成后第0、5、10、15、30 min 测定溶液的色谱峰面积，结果见表2。由表2 可知，随着样品溶液放置时间的延长，色谱峰面积逐渐减小，因此应尽量缩短样品放置时间。因滴定完成后样品略显浑浊，需静置分层，综合考虑，样品溶液配制完成后应在5 min 内取样测定，即样品溶液放置时间为5 min。

表2 样品溶液不同放置时间的色谱峰面积

2.2 色谱条件选择

分别选择常用的气相色谱柱SE-30 柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm，兰州中科安泰分析科技有限公司)、DB-WAX 柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，安捷伦科技有限公司)、DB-624柱(30 m×0.32 mm，1.8 μm，安捷伦科技有限公司)进行考察。结果表明，采用SE-30 柱时，色谱峰的理论塔板数大于20 000，各峰的拖尾因子均约为1.0，氯乙酰氯和二氯乙酰氯的分离度大于2.0，各峰的响应值较好，满足检测需要，因此选择SE-30 柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm)。

依据氯乙酰氯的沸点和出峰时间，保证在分离度和响应值符合检测要求的情况下，以样品于20 min 内出峰作为筛选目标，对初始柱温和升温程序进行了优化，优化结果见1.3。

2.3 色谱图

分别移取空白溶液、加标样品溶液和二氯乙酰氯、氯乙酰氯混合对照品溶液，按1.3 色谱条件进样测定，色谱图如图1 所示。由图1 可以看出，空白溶液在二氯乙酰氯衍生物保留时间附近无色谱峰，说明样品基质不干扰二氯乙酰氯的检测；加标样品溶液和混合对照品溶液中氯乙酸正丁酯和二氯乙酸正丁酯色谱保留时间分别为11.637、13.723 min，二者的分离度为10.3，表明分离效果良好。

图1 空白溶液、样品溶液、混合对照品溶液色谱图

2.4 线性关系

按照1.3 色谱条件，分别对二氯乙酰氯系列标准工作溶液进样测定，以色谱峰面积为纵坐标(y)、对应的二氯乙酰氯质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，计算线性方程和相关系数。结果表明，二氯乙酰氯的质量浓度在0.8～2.4 mg/mL 范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性方程为y=0.039 7x-2.318 1，相关系数为0.999 5。

2.5 检出限与定量限

取质量浓度为0.8 mg/mL 的二氯乙酰氯标准工作溶液，用正丁醇逐级稀释，在1.3 色谱条件下分别进样测定，当二氯乙酸正丁酯色谱峰的信噪比为10时，对应的二氯乙酸正丁酯质量浓度即为二氯乙酰氯的定量限，定量限为29.77 μg/mL；取二氯乙酰氯的定量限溶液，用正丁醇稀释并测定，当色谱峰信噪比为3 时，对应的二氯乙酸正丁酯的质量浓度即为二氯乙酰氯的检出限，检出限为8.93 μg/mL。

2.6 精密度试验

平行取6 份样品，按1.2 方法制备样品溶液，在1.3 色谱条件下测定二氯乙酰氯的质量浓度。根据取样量和定容体积，换算成样品中的含量，以质量分数表示，测定结果见表3。由表3 可知，6 份样品溶液中二氯乙酰氯的平均质量分数为0.42%，测定结果的相对标准偏差为2.0%，表明该方法精密度良好。

表3 精密度试验二氯乙酰氯质量分数测定结果 %

2.7 加标回收试验

取50 mL 锥形瓶，分别加入3.6、3.4、3.2 mL 正丁醇，再各加入0.8 mL(约1.0 g)氯乙酰氯样品，然后分别加入0.6、0.8、1.0 mL 质量浓度为10 mg/mL的二氯乙酰氯对照品溶液，按1.2 方法制备加标质量浓度分别为1.2、1.6、2.0 mg/mL 的样品溶液，每种加标质量浓度水平的样品平行制备3 份，在1.3 色谱条件下分别进行测定，计算二氯乙酰氯的回收率，结果见表4。由表4 可知，二氯乙酰氯的回收率为103.29%～111.99%，表明该方法准确度较好。

表4 加标回收试验结果

3 结语

氯乙酰氯化学性质活泼，采用气相色谱法直接进样测定，会损坏色谱柱的固定相，根据氯乙酰氯的化学性质，其可以与醇类化合物反应生成对应的酯，且该反应为定量反应，回收率高，故可采用柱前衍生化气相色谱法间接地对氯乙酰氯中的特定杂质二氯乙酰氯进行定量检测，该方法简单，易操作，检测效率高，检测能耗低。