烟草赤星病高效生防内生细菌的分离筛选及发酵培养条件优化

蔡永占， 白 涛， 刘冬梅， 邱春丽， 符宗伟， 朱颖勋， 华小兵， 赵崇钧， 张 琪

(1.云南省烟草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；2.云南省微生物发酵工程研究中心有限公司，云南昆明 650217)

烟草赤星病(tobacco brown spot disease，TBSD)是由链格孢菌在烟叶成熟时期侵染造成病斑的一种真菌性病害，在各烟区普遍发生，直接影响烟叶的产量和品质，给烟农带来巨大的经济损失，是烟草生产上威胁最大的病害之一。现阶段对烟草赤星病的防治方法主要有2种。一种是筛选具有抗病性的烟草品种或通过田间措施增强植株抗性；另一种是使用化学药剂防治。目前国内针对烟草赤星病的化学药剂主要有氟硅唑、异菌脲、菌核净、嘧菌酯、醚菌酯、多菌灵、甲基硫菌灵和腐霉利等。化学药剂防治虽取得了一些成效，但因其选择性差、高残留和不易降解，也造成了生态环境被破坏、烟叶品质下降、环境污染加重、抗药性问题日益突出等后果，且赤星病一般在烟叶成熟期发病，农药残留会影响卷烟质量及人类身体健康。因此研究开发出能防治赤星病的生物防控技术尤为重要。

筛选烟草赤星病病菌拮抗菌是实施生物防控的一项重要工作，也是近年来国内外科研工作者研究的热点。方敦煌等从烟草赤星病病斑上分离得到14株拮抗赤星病病菌的微生物，对峙培养发现其中6株对赤星病主要病原链格孢菌()具有不同致病力的6个菌株均具拮抗作用；马冠华等从几个不同烟草品种的不同生长时期的不同生长部位中分离得到近 2 000 株内生细菌，经过筛选得到4株对赤星病菌的生长都有较强抑制作用的细菌；马志远从陕西、云南、湖北和河南 4 省烟区的烟草根际土壤和烟叶中分离筛选到10株对赤星病菌有拮抗效果的芽孢杆菌，其中 M-07 菌株的拮抗效果最好，抑菌条带宽度达到14.2 mm。目前，大多数研究还只停留在实验室阶段，少见烟草赤星病病菌拮抗菌规模化生产应用的报道，同时由于大多数拮抗菌的针对性不强，导致田间应用的防治效果和稳定性都相对较差。本研究以曲靖烟区分离得到的烟草赤星病病原菌为靶标，从曲靖烟区健康烟株内分离得到高效生防内生细菌，并对其发酵培养基进行优化，旨在为其规模化生产应用奠定基础，为曲靖烟区烟草赤星病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

1.1.1 试验时间 2020年2月7日至6月23日。

1.1.2 试验地点 云南省安宁市青龙镇禹龙甸云南省微生物发酵工程研究中心有限公司实验室。

1.2 供试材料

1.2.1 供试菌株 供试的烟草赤星病病原真菌链格孢菌由笔者所在课题组前期从曲靖烟区的病叶上分离纯化获得，现保藏于云南省微生物发酵工程研究中心有限公司菌种库，菌株编号：YWFB-19-0013。

1.2.2 供试植株 供试健康烟株的根、茎、叶采自云南省曲靖市宣威市、麒麟区和师宗县，烤烟品种为K326。

1.2.3 供试培养基 LB培养基：用于烟草内生细菌的分离培养。配方如下(1 L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，加入蒸馏水定容至1 L，充分溶解后，调节pH值至7.0，经121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min 即可。加入1.5%琼脂，同等条件灭菌，即可得到LB固体培养基。

马铃薯蔗糖(PSA)培养基：用于具拮抗作用的生防菌株筛选。配方(1 L)如下：马铃薯200 g，蔗糖14 g，加入蒸馏水定容至1 L，充分溶解后，经121 ℃高压蒸汽灭菌15 min即可。加入1.5%琼脂，同等条件灭菌，即可得到PSA固体培养基。

发酵培养基原始配方：用于拮抗菌发酵培养基的优化。配方(1 L)如下：大豆粉14 g，蛋白胨2 g，玉米粉4 g，碳酸钙6 g，鱼粉2 g，蔗糖3 g，氯化钠0.3 g，磷酸二氢钾0.3 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸锰0.2 g，硫酸镁0.3 g，硫酸铵0.5 g，加入蒸馏水定容至1 L，充分溶解后，经121 ℃高压蒸汽灭菌15 min即可。

1.3 试验方法

1.3.1 烟草内生细菌的分离 将烟草的根、茎、叶分别用自来水冲洗干净后，先在70%乙醇中振荡浸泡1 min，再用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液振荡浸泡1～5 min进行表面消毒后，用灭菌水冲洗3次，于灭菌的研钵中研磨，将研磨汁液涂布于LB平板上。以组织消毒后用灭菌水冲洗的最后一次冲洗液涂板作为对照，检测样品表面消毒是否彻底，如长菌落，研磨液所涂平板上长的菌落为非内生细菌，弃去；若对照中无菌落，在研磨液中长出的菌落可能是内生细菌，随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存。

1.3.2 链格孢菌拮抗内生细菌的初筛和复筛 以烟草赤星病病原菌为指示菌，在PSA平板底部中心用记号笔点上一个点，以它为中心，在距离中心 3 cm 处按十字交叉点上4个点，将烟草赤星病病原菌菌饼接在PSA平板中心，在距中心3 cm 处的4个点上用接种环点接分离出的烟草内生菌，以中心向四周辐射方向未点接烟草内生菌为空白对照，各平板正置于28 ℃培养1周，测量不同烟草内生菌对烟草赤星病病原菌的抑制效果。

用同样的方法将初筛中抑菌带较宽的菌株进行复筛，各平板正置于28 ℃培养24 h后测定复筛菌株对烟草赤星病病原菌的抑菌率。

1.3.3 拮抗内生细菌发酵培养基优化研究 应用Design-Expert软件，采用响应面法对抑菌率最高的拮抗菌进行发酵培养基的优化。配制Design-Expert软件程序设计的培养基配方，以1/1 000的接菌量接入种子液，于35 ℃，160 r/min的恒温摇床内培养72 h后取样检测其菌含量。

1.3.4 数据统计与分析处理

采用 Excel 和 Design-Expert软件来进行试验数据的分析与处理。

2 结果与分析

2.1 烟草内生细菌的分离

将所采集的烟草根、茎、叶表面消毒后，一共分离得到71株内生细菌，将其编号为YWF-19-0001至YWF-19-0071。部分内生细菌的平板照片见图1。

2.2 链格孢菌拮抗内生细菌的筛选

以分离得到的71株烟草内生细菌为目标菌，采用对峙平板法测定其对链格孢菌的抑制作用。由表1可知，对链格孢菌具有抑制作用的有22株，其中抑菌带宽度≥10 mm的有5株，5 mm≤抑菌带宽度<10 mm的有7株，抑菌带宽度<5 mm的有10株。部分内生细菌对链格孢菌的抑制效果见图2。

表1 拮抗链格孢菌内生细菌初筛结果

2.3 链格孢菌拮抗内生细菌的复筛

将上述试验中效果较为明显的5株内生细菌再次对烟草赤星病病菌进行拮抗验证，对病原菌菌丝生长的抑制效果如表2所示。从表2可知，YWF-19-0004 、YWF-19-0065、YWF-19-0068、YWF-19-0070 和YWF-19-0071的平均抑菌带宽度分别为10.6、10.3、12.5、11.8、12.3 mm，抑菌率分别为51.25%、50.67%、56.70%、53.33%和55.58%。

表2 拮抗内生细菌对链格孢菌菌丝生长的抑制效果

2.4 生防内生细菌发酵培养基的优化

2.4.1 主要影响因素的确定 应用Design-Expert软件，采用响应面法对抑菌率最高的YWF-19-0068菌株进行发酵培养基的优化。响应面法的Plackett burman 设计是从多种因素中选取对试验指标有显著影响的因子，为下一步研究提供参考。影响发酵液菌量的碳源有碳酸钙、蔗糖、玉米粉。氮源有大豆粉、蛋白胨、鱼粉。PB试验筛选YWF-19-0068菌株基础发酵培养基中的显著因子，对基础培养基的6个组分：玉米粉(A)、大豆粉(B)、鱼粉 (D)、碳酸钙(E)、蛋白胨(G)、蔗糖(H)进行全面考察，选择11因子2水平的试验设计，增加5个虚拟项(C、F、J、K、L)来估计试验误差。每个因子取高低2个水平。分别取高值和低值为：玉米粉浓度4、8g/L，大豆粉浓度10、16g/L，鱼粉浓度2、6 g/L，碳酸钙浓度4、8 g/L，蛋白胨浓度2、6 g/L，蔗糖浓度5、10 g/L。PB试验设计与结果如表3所示。

利用响应面分析软件对表3中的试验数据进行分析，得到回归模型方差分析和各因素的主效应结果(表4、表5)，该模型的值为0.019 5<0.05，说明该模型显著，能较好地拟合数据。根据值的大小可以判定，培养基中各因子对YWF-19-0068菌株菌量影响的重要性排序为 蔗糖浓度>玉米粉浓度>碳酸钙浓度>蛋白胨浓度>鱼粉浓度>大豆粉浓度。蔗糖浓度、玉米粉浓度和碳酸钙浓度3个因子的值均小于 0.05，说明其对YWF-19-0068菌株菌量有显著影响，因此选定蔗糖浓度、玉米粉浓度和碳酸钙浓度作为下一步试验的关键因素。

表3 PB 试验设计及结果

表4 Plackett burman 试验分析与结果

表5 Plackett burman 试验回归分析结果

2.4.2 最适浓度范围的确定 对蔗糖 、玉米粉和碳酸钙浓度3个主要影响因子进行最陡爬坡路径试验，确定此3个因子的最适浓度范围(表6、图3)。 蔗糖、玉米粉和碳酸钙浓度对发酵液含菌量均是正影响，为正值，当蔗糖浓度为11 g/L，玉米粉浓度为7 g/L，碳酸钙浓度为5 g/L 时对应的发酵液含菌量达到最大值，对链格孢属病原菌抑菌率达67%以上，为3个因子的最大响应值区域。

表6 最陡爬坡路径试验设计及结果

2.4.3 响应面分析 采用 Box-Behnken 的中心组合设计原理，以蔗糖浓度11 g/L、碳酸钙浓度5 g/L和玉米粉浓度7 g/L为中心点施行响应面分析，设计3 因素3水平的响应面分析试验，各自变量水平见表7，试验设计及结果见表8。

表7 响应分析法设计因子及水平

表8 响应分析法试验设计及结果

1511029.0516-10130.451700038.56

响应面分析法对菌含量浓度的分析见表9，由表9可知，本试验二次多项回归方程的值小于 0.05，说明模型显著，回归方程失拟项检验值为 0.235 9>0.05，说明失拟项不显著，未知因素对试验结果干扰小。拟合检验显著，说明所建立的模型是有效的，与实际情况拟合，3 个参数对菌含量浓度的影响是显著的。

表9 响应面分析法对菌含量浓度的分析

根据回归方程所做出的响应曲面和等高线图见图4。如果等高线图形呈椭圆形，说明2个因素的交互作用显著，如呈圆形，说明交互作用不显著；等高线的密集程度可说明该因子对菌含量影响的大小。由图4可以看出，等高线为椭圆形，说明交互作用显著。等高线的疏密可以看出玉米粉浓度和碳酸钙浓度对菌含量的影响>蔗糖和玉米粉浓度对菌含量的影响>蔗糖和碳酸钙浓度对菌含量的影响。

2.4.4 优化试验验证 在相同的发酵条件下利用基础培养和优化后的培养基对YWF-19-0068菌株进行发酵的结果见表10。从表10中可以看出，采用优化后的培养基进行发酵，菌量为36.85×10CFU/mL，是基础培养基发酵所得菌量8.24×10CFU/mL 的4.47倍。

表10 发酵培养基优化前后的结果对比

3 讨论与结论

国家烟草专卖局提倡绿色防控理念，减少化学农药使用，采用微生物菌剂或其他绿色防控措施替代化学农药，这已经成为烟草病虫害防控的主要思路。因此，筛选出具有生防功能的微生物，将其应用到烟草生产中，并评价其针对烟草赤星病的防控效果，对烟草赤星病防控、生态环境保护以及人们生命健康具有重大意义。而在进行工业发酵时，碳源和氮源是微生物细胞和代谢产物的重要营养物质，也是发酵培养基的重要组成部分，不同细菌对各种营养物质的需求量不同。通过优化发酵培养基配方，提高发酵液中的菌含量，为大规模工业化生产奠定基础，有助于降低生产成本，提高制剂的生防效果。

本研究利用烟草鲜样，分离出烟草内生细菌共计71株，编号YWF-19-0001～YWF-19-0071，并以烟草赤星病病原真菌链格孢菌为指示菌， 筛选出15株对其具有拮抗作用的菌株。针对其中抑制作用效果较好的菌株进行复筛，最终得到5株抑菌带宽≥10 mm、抑菌率≥50%的拮抗菌，编号分别为YWF-19-0004、YWF-19-0065、YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071。

应用Design-Expert软件，采用响应面法对抑菌率最高的YWF-19-0068菌株进行发酵培养基的优化研究，获得YWF-19-0068菌株的优化培养基配方：大豆粉浓度14 g/L，蛋白胨浓度2 g/L，鱼粉浓度2 g/L，蔗糖浓度11 g/L，玉米粉浓度为 7 g/L，碳酸钙浓度5 g/L，氯化钠浓度0.3 g/L，磷酸二氢钾浓度0.3 g/L，磷酸氢二钾浓度0.3 g/L，硫酸锰浓度0.2 g/L，硫酸镁浓度0.3 g/L，硫酸铵浓度0.5 g/L。利用优化培养基进行发酵，YWF-19-0068菌株的菌量为36.85×10CFU/mL，是基础培养基发酵所得菌量8.24×10CFU/mL的4.47倍，说明优化培养基能有效提高YWF-19-0068菌株的菌量，有助于降低生产成本，具有较高的实用价值。

总而言之，从健康的烟草植株中，可筛选出烟草赤星病高效生防内生细菌，通过对其发酵培养基进行优化研究，可以有效提高生防菌的菌量，为其规模化生产奠定基础。本研究团队将继续进行烟草内生菌株防治烟草赤星病的研究，旨在将筛选出的菌株制成菌剂应用于田间，并研究其田间验证效果，为烟草内生菌株在烟草赤星病防控方面提供基础及技术支撑，也为其在后期的推广应用提供数据支撑。