贫血样本手工推片与自动化推片用于数字化阅片仪的对比研究

黄小天，张 斌，邱婧璐，欧 华

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院 a.临床医学检验中心，b.骨科，四川 成都 610072；2.成都市新津区人民医院检验科，四川 成都 611436)

在外周血检测中贫血是最常见的情况，很多疾病如：白血病、骨折等创伤失血、缺铁、血红蛋白病、孕产期贫血等都会直接导致血红蛋白含量降低造成贫血[1]。贫血样本由于血红比含量较低，手工推片时往往难以把握好血滴量及推片角度和力度，影响推片质量从而影响镜检分类外周血细胞。自动推片机可通过检测外周血红细胞比容(hematocrit, HCT)值来控制血推片的角度和力度，保证血推片的质量，数字化细胞形态阅片仪可提升外周血涂片的阅片速度、降低漏诊的概率，并具有外周血推片质量分析软件CellaVision SmearChecker模块功能[2]。本研究通过选取贫血样本，采取自动推片和手工推片的方法制备样本，采用CellaVision SmearChecker模块功能分析其推片质量，并对白细胞分类结果与人工显微镜镜检进行相关性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2020年2～10月选取四川省人民医院临床送检样本100例。在临床医生要求检测全血细胞计数的样本中选取血红蛋白<80 g/L的贫血样本，排除血红蛋白>80 g/L的贫血样本。经过Sysmex XN自动血球分析仪进行流水线分析后，红细胞(RBC)(1.72～3.00)×1012/L，血红蛋白(HGB)38～80 g/L，白细胞(WBC)分类正常45例，分类异常55例，其中7例WBC数为(0.24～1.00)×109/L。将100例外周血样本分别进行自动推片机制片和人工手工推片，每组50例，并将两种方法制得的血片进行染色分析。

1.2 仪器与试剂全自动细胞形态分析仪DI-60(瑞典 CellaVision AB公司)；自动血细胞分析仪XN(日本 希森美康Sysmex公司)；自动推片机SP-10(日本Sysmex公司)；人工显微镜(日本奥林巴斯Olympas公司)；瑞氏-吉姆萨染液(珠海贝索生物技术公司)。

1.3 样本收集与制备样本的采集与检测按照《全国临床检验操作规程》第3版进行[3]，采用自动血细胞分析仪XN进行血常规的检测。分别采取自动推片机SP-10进行制片和手工推片进行制片，将两种方式制得的血片均用自动推片机SP-10进行染色。

1.4 样本分析方法

1.4.1推片质量分析方法 采用外周血推片质量分析软件CellaVision SmearChecker对自动推片手工推片的样本进行质量分析，SmearChecker软件在DI-60上使用，可以对外周血制片标准[4]中推片样本中进行染色酸碱度、染色强度及单层长度进行分析。本次染色方法通过SmearChecker软件进行质控，调至染色酸碱度及强度在最佳范围内，通过SmearChecker对自动推片和手工推片的单层细胞长度进行分别进行统计分析[7]并比较两组差异。SmearChecker软件中绿色代表单层细胞良好区域、黄色代表单层细胞一般区域及红色代表单层细胞较差区域。

1.4.2单层红细胞统计分析方法 采用DI-60外周血涂片分析功能进行数字化分析及人工神经网络分析，分别统计自动推片和人工推片样本，红细胞概览图中不重叠的红细胞数量[5]，并对两组数据进行统计分析。

1.4.3人工显微镜镜检和数字化细胞形态阅片仪白细胞分类方法 采用人工显微镜镜检的方式，2名临床检验技师进行审核，计数100个白细胞，统计中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及原始幼稚细胞的百分比，采用DI-60对外周血涂片进行白细胞分类，计数100个白细胞，统计中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的百分比，对两组数据进行决定系数(R2)线性分析，对比自动推片和人工推片的一致性分类结果。

1.5 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。计量资料比较采用t检验，相关性分析采用线性相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞系统推片质量比较自动推片组单层长度为(0.87±0.37)cm，显著高于手工推片组的(0.51±0.33)cm，差异有统计学意义(t=8.99，P<0.01)。自动推片组的单层细胞合格率为80%，显著高于手工推片组的42%，差异有统计学意义(χ2=18.37，P<0.01)。

2.2 红细胞数量比较两种推片方式制备的样本分别在DI-60外周血涂片分析功能进行数字化分析及人工神经网络分析，统计两组的不重叠红细胞数量，自动推片组红细胞计数(1116±222)个，显著多于手工推片组(787±392)个，差异有统计学意义(t=4.57，P<0.01)。

2.3 人工显微镜镜检和数字化细胞形态阅片仪白细胞分类线性相关分析选取血液科贫血且白细胞分类异常含有幼稚细胞的45份样本以及白细胞分类正常的55份样本，用两种推片方式制备的样本分别在人工显微镜镜检和DI-60外周血涂片分析功能进行白细胞分类(图1)，自动推片组中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及原始幼稚细胞的数字化细胞形态阅片仪与人工显微镜镜检白细胞分类结果相关性更高(P<0.05)，见表3。

图1 推片机SP-10制片与手工制片白细胞分类结果对比图 a：SP-10；b：手工

表3 DI-60分类与人工显微镜分类线性相关分析(r)

3 讨论

DI-60中通过外周血推片质量分析软件SmearChecker，可以用来检测外周血推片染色酸碱度、染色强度及单层细胞层长度。当细胞单层区域较小时，为了计数够100个白细胞用于临床诊断，定位在非单层区域的白细胞可能受到挤压导致形态的改变，严重时可能发生重叠，导致增大细胞形态识别的难度，降低细胞分类的准确性[6]。本研究结果表明，自动推片机SP-10制备的样本，与手工推片组比较，其单层细胞层长度平均值更大、合格率更高，说明对于贫血样本自动推片的方法更能得到推片质量稳定的样本。无论的是采取数字化细胞形态阅片仪阅片，还是人工显微镜镜检阅片，检验单层细胞的长短就是判定一张血片的合格与否的重要指标[6，7]。

DI-60外周血涂片分析功能具有扫描红细胞概览图的功能，过多的红细胞重叠，红细胞形态无法得到准确的分析。本研究结果表明，在同样数量的视野下，自动推片机SP-10制备的样本，与手工推片组比较，其红细胞概览图中不重叠的红细胞数量更多，说明对于贫血样本自动推片的方法可以制备更高质量的红细胞单细胞层，与曾素根等[7]结论一致。

目前，人工显微镜镜检作为外周血白细胞分类的金标准，其主要是通过人工找寻血推片体尾交界处单细胞层，人工计数100个白细胞进行分类；然而，数字化细胞形态阅片仪的出现，是通过模拟人工显微镜镜检的方式，首先在血推片体尾交界处寻找单细胞层，然后定位找寻目标数量的白细胞。

阅片机计数可以设置100个白细胞或更多数量，如200个或300个白细胞。其全自动细胞形态分析系统，具有10倍、50倍或100倍的放大倍数的显微镜，其彩色摄像头,可获得最佳的图像质量和高速的图像采集，最终通过DI-60细胞形态分析软件进行对细胞类别进行分析[8，9]。其分类的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及原始幼稚细胞的相关性均有相对的提升，说明自动推片法制备的样本，具有高质量、稳定的单细胞层区域，更有利于外周血白细胞分类的准确性与邢莹等[10，11]结果一致。之后通过人工神经网络进行预分类，临床检验技师在电脑显示器上进行审核结果。

综上，针对贫血患者的血液涂片分析，经自动推片法制备的血涂片结果，其单层细胞层区域评价更优、红细胞单层细胞层数量及白细胞分类结果与人工显微镜镜检的吻合度更高，故优于手工推片制备的血涂片。根据本研究的经验表明，贫血样本血液粘稠度较清，手工推片更加难以掌握其推片的角度和力度，也更加耗时费力，且制作的血片差异很大质量稳定性不强[12]。因此，在以后的标准化管理中通过使用自动推片法推片染色后经DI-60的阅片人工复核后所得到的结果更加准确、稳定且高效。