肿瘤患者粪菌移植偏好调查及其肠道菌群组成特征分析

李明霞，杨与珍，岳志瑛，李俊英，郑儒君

(1.四川大学华西医院 a.胸部肿瘤科，b.生物研究治疗病房，四川 成都 610041；2.四川大学华西护理学院，四川 成都 610041)

粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是指从健康供体的粪便中提取功能菌群移植到患者肠道，以达到治疗疾病的目的[1, 2]。人体胃肠道内生存着一千多种微生物，维持人体微环境的平衡,参与调节免疫、新陈代谢、细胞反应等生理功能[3]。越来越多的研究表明肠道菌群可以促进免疫治疗功效，影响放疗、化疗的疗效及相关不良反应的发生[4,5]，对肿瘤患者有利。除此以外，研究还发现补充乳酸菌和双歧杆菌等益生菌与减少抑郁症的发生有关[6],可见肠道菌群组成甚至能影响情绪、认知和心理健康。已有研究发现FMT可以治愈抑郁症，且无明显不良反应[7]，从而提示了FMT或将成为一种有效的崭新的肿瘤治疗方法[4, 8]。但至今我们却处于了解肠道菌群作用机制复杂性的早期阶段[9]，关于患者对FMT偏好的相关研究极少，并且肿瘤患者肠道菌群的组成特征与患者心理健康有何关联更待进一步研究和探索。研究表明，心理痛苦与焦虑、抑郁、恐惧等负性情绪密切相关[10]，已成为第6大生命体征，可反应肿瘤患者的心理健康状态。基于以上，本研究旨在通过问卷调查肿瘤患者是否愿意选择FMT，探究他们对FMT的态度和偏好及影响因素，并将心理痛苦作为反映肿瘤患者心理健康的指标，通过16S rRNA高通量测序技术检测有无心理痛苦的肿瘤患者肠道菌群的组成特征及结构差异, 以期为今后的临床实践及机制研究提供重要参考和循证依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料采用便利抽样的方法，选择2018年9月1日至2018年9月30日四川大学华西医院收治的120例肿瘤患者作为研究对象。纳入标准：①通过病理学诊断为恶性肿瘤；②年龄≥18岁；③生存时间≥3个月，了解疾病进展；④能够读写中文。排除标准：①处于危急状态；②有认知障碍或精神病；③由于各种原因未能完成问卷，导致数据丢失。本研究符合赫尔辛基宣言。在知情同意后由研究者对研究对象进行问卷调查。

1.2 研究方法

1.2.1一般资料调查表 采用自行设计的调查问卷以评估肿瘤患者对FMT的态度和偏好。问卷包括调查患者一般资料和临床指标的10个问题(性别、年龄、教育程度、医保类型、肿瘤分期、美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力状况(performance status，PS)评分和直接与FMT相关的3个问题(患者对FMT的意愿、供体、途径的偏好)[11, 12]。

1.2.2心理痛苦温度计(Distress Thermometer,DT)

采用DT对研究对象进行评估，并根据结果将其分为有心理痛苦组和无心理痛苦组。DT的评估方法为视觉评分法，0分表示没有痛苦，10分表示极度痛苦，患者在0～10之间评分，当DT≥4分即存在显著心理痛苦。DT临界值取4分时敏感度和特异度分别为0.82和0.73, 具有良好的信效度[7]。本研究无心理痛苦6例患者(评分1～3)，有心理痛苦5例患者(评分4～8)，共11例患者同意研究者收集自己的粪便样本做高通量测序。

1.2.316S rRNA高通量测序技术 采用16S rRNA高通量测序技术对样本肠道菌群进行群落组成分析和差异物种分析。

1.3 数据收集本研究结合了横断面调查和基础实验研究。研究者使用统一的指导语告知患者研究目的，并向他们解释粪菌移植的概念、目的和意义，之后进行调查。研究者仅仅记录患者的回答，不能试图影响或引导患者的立场和观点。本次调查收回有效问卷101份(回收率84.2%)。

询问患者是否愿意将粪便送检，征得同意之后由一名研究者收集粪便,置于灭菌冻存管中,液氮冻存,随后转置于-80 ℃冰箱保存。使用脱氧核糖核酸(DNA)试剂盒进行基因组DNA 抽提后，电泳检测DNA。通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得16S rDNA基因V4标签片段，选择Illumina公司构建平台文库，并于Illumina平台进行高通量测序。研究中的所有数据都将严格保密，并且只作研究使用。

1.4 统计学方法应用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。用Kruskal-Wallis检验推断不同人口学特征的患者对FMT供体、移植途径的偏好的差异。Logistic二元回归分析与FMT意愿有关的影响因素。使用定量分析微生物生态学(quantitative insights into microbial ecology,QIIME)软件将操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的代表序列与SILVA数据库进行比对注释；根据OTU分析结果，进行群落组成分析和差异物种分析。统计和作图主要使用R6、python和java软件完成。采用机器学习中的随机森林法对菌群组成差异进行比对分析，找出差异性菌属。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料本研究纳入了符合标准的101例肿瘤患者，平均年龄为53.6岁(20～81岁)，大多数患者(99例)的肿瘤分期是Ⅱ～Ⅳ期。研究对象的一般资料见表1。

表1 101例患者一般资料 [n(%)]

2.2 患者对FMT意愿的影响因素分析101例患者中92例(91.1%)表示愿意选择FMT，9例(8.9%)没有选择。Logistic多元回归分析显示，文化水平和肿瘤分期是FMT意愿的影响因素，见表2。患者年龄、性别、民族、宗教、医疗保险、婚姻状况、生活状况、原发肿瘤部位、收入和体力状况评分等因素与是否接受FMT无关(P>0.05)。

表2 患者对FMT意愿的影响因素分析

2.3 患者对FMT供体的选择Kruskal-Wallis检验表明，不同年龄和不同文化水平的肿瘤患者在选择FMT供体的偏好上差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。老年患者更希望接受陌生人的粪菌，初中或初中以下文化程度的肿瘤患者更倾向于接受亲属的粪便进行FMT。

表3 不同人口学特征肿瘤患者FMT供体偏好的差异 (n)

2.4 患者对FMT途径的选择Kruskal-Wallis检验结果表明，不同性别和不同PS评分的患者在选择FMT移植途径方面差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。 PS评分较低的肿瘤患者表明更愿意通过口服的途径进行FMT。同时，较高比例的女性患者也愿意采取口服的方式来完成FMT。

表4 不同人口学特征肿瘤患者FMT途径偏好的差异 (n)

2.5 肿瘤患者肠道细菌群落组成的差异高通量测序技术分析显示：心理痛苦组(Con)变形菌门的丰度明显高于无心理痛苦组(Dis)，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度明显低于无心理痛苦组(图1a)。在属水平上，心理痛苦组拟杆菌丰度低于无心理痛苦组(图1b)。机器学习中的随机森林分析显示，两组患者的粪便样本中Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌的丰度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

图1 无心理痛苦肿瘤患者与有心理痛苦肿瘤患者粪便微生物群优势菌群的相对丰度 a:患者粪便微生物群在门分类级别的丰度；b:属分类水平高丰度微生物群桑基图

表5 无心理痛苦组与有心理痛苦组粪便微生物群优势菌群属分类水平丰度比较

3 讨论

肠道菌群已成为当今医学与生命科学研究的热点领域，基于FMT的潜在治疗前景，本研究调查了肿瘤患者对于FMT的意愿、供体、途径的态度和偏好，研究结果有一定临床价值。国外一项随访研究表明，97%的复发性艰难梭菌感染患者较抗生素而言更喜欢FMT[11]。Jalanka等[12]研究报告也与我们的结果相似，本研究表明91.1%的肿瘤患者愿意选择FMT作为肿瘤治疗的一个可选方案。肿瘤患者对粪菌移植的态度是积极的，当未来FMT疗法成为一种新的恶性肿瘤辅助治疗方法时，能被患者接受。医护人员应根据患者的文化水平进行个体化的指导，有助于患者理解和接受FMT。

FMT的供体包括配偶、直系亲属、其他家庭成员、朋友或伴侣以及陌生人[11]。尽管患者与直系亲属和/或配偶有共同的遗传背景和生活习惯，但在未患病的亲属的肠道菌群中没有观察到与患者一致的特征，因此受者和供体之间的亲密关系不会影响FMT的效果[13]。在我们的研究中，肿瘤患者更喜欢选择配偶和亲属作为供体，比例占65.2%。这是因为配偶和亲属作为家属，与患者形成了一种持久的情感联系，是患者认为的能够给予自己安全感的特定对象[14]，所以患者更愿意选择他们。本研究发现，随着年龄的增长和文化水平的提高，选择陌生人作为其供体的患者比例也有所增加，这与他们的阅历和知识储备有关。粪菌移植作为一项新型的“器官移植”，涉及到供体的选择和筛查，而随着粪便银行和粪菌库逐步建立，供体的粪便样本逐渐增多[15]，患者可能在陌生人中筛选到更合适的供体。因此，不论患者偏好的供体是什么身份，更重要的是供体的菌群是否合格。

国内外研究显示，可通过保留灌肠、鼻胃管、结肠镜、胃镜和食管胃十二指肠镜来进行FMT[16,17]。一项系统评价显示，通过保留灌肠或结肠镜进行的FMT比通过胃镜或鼻胃管更有效[18]。但在我们的研究中，大多数肿瘤患者希望通过口服来完成粪菌移植，这是因为口服比其他给药途径更便捷且易于接受。Zhang等[19]着力于粪菌冻干与胶囊制剂等技术研发，随着粪便制备设备和口服胶囊制剂的工业发展，更多患者可能受益，不仅减少了传统观念下对粪便的顾虑，还考虑到患者的偏好，提高了用药方便性，甚至疗效。

既往研究表明肠道菌群与慢性应激存在直接关系[7]。本研究对11例肿瘤患者进行了肠道菌群多样性组成和差异性物种分析，发现在无心理痛苦的肿瘤患者的肠道菌群中，Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌丰度均高于有心理痛苦组(P<0.05)。有研究表示，Flavonifractor菌是重要的肠道细菌，有助于缓解Th2主导环境中抗原特异性Th2的免疫应答，可以作为益生菌治疗过敏反应[20]；Akkermansia菌拥有粘附粘液层的能力，可以保护肠道上皮细胞免受微生物攻击，并为微生物提供生长能量，Akkermansia菌含量低可能导致肠屏障功能减弱，使毒素更容易侵入宿主。Akkermansia菌被认为是一种很有研究前景的益生菌[21]；Zhao等[22]发现桥本甲状腺炎患者的Lachnoclostridium菌的数量比正常患者减小，说明Lachnoclostridium菌有利于机体的免疫应答；Zhou等[5]发现Tyzzerella-3菌的丰度水平与抑郁症状的严重程度之间存在负相关，而本研究发现心理痛苦组的粪便样本中不存在Tyzzerella-3菌。以上这些研究结论与本研究结论类似，提示Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌对肿瘤患者有益。Anaeroglobus菌是一种厌氧菌,Fåk等[23]研究认为，口腔内大量的Anaeroglobus菌会加重全身炎性反应，不利于宿主健康，这与我们的研究结果不同，原因可能在于：研究对象不同，各研究对象在基础疾病、年龄、生活饮食习惯等方面存在差异[24]。我们的研究结果显示发生心理痛苦的肿瘤患者肠道菌群的组成发生了变化，特定菌属可能会通过某种机制影响宿主的心理健康，这一发现为今后肠道菌群与肿瘤患者心理的机制研究开拓了思路。

综上，本研究发现肿瘤患者愿意接受粪菌移植作为一种肿瘤综合治疗方法，有心理痛苦与无心理痛苦的肿瘤患者的肠道菌群组成存在差异，提示肠道菌群的组成会影响肿瘤患者的心理状态，为开展肠道菌群与肿瘤心理应激之间的环路机制及调控因子的研究提供了新的思路和循证医学依据，对临床具有重要的参考价值。本研究局限性在于问卷调查和基础实验的样本来自单中心，且样本量较小，需要更大的样本和更多更完善的动物实验进一步验证本研究结果的准确性。