7 种新发传染病高通量悬浮芯片检测方法的建立

闫冀焕 沈 军 周新霞 河北国际旅行卫生保健中心（石家庄海关口岸门诊部） （河北，石家庄，050091）

周汝明 河北省人民医院（河北，石家庄，050000）

梁 宏 绥芬河海关综合技术中心（绥芬河海关口岸门诊部） （黑龙江，绥芬河，157399）

新发传染病 （emerging infectious disease，EID）是指由新产生（发现）的病原体，以及通过突变而产生新的生物特征的已知病原体，而导致的人与动物感染性疾病［1-2］，由于其不确定性、无法预测性，已形成全球性的一大公共卫生问题[2-3］。 新发传染病的病原体分为病毒、立克次体、病菌、衣原体、双螺旋体和寄生虫等［4］，尤其以病毒为主。由于人们对新发传染病了解不够，常常无法在疫病传播早期迅速检出病原体，同时由于人们对大多新发传染病无自然抵抗力，常常引起全球范围内的大面积传播。 由此可见，新发传染病的迅速正确检出在其预防中必不可少。 目前实验室对新发传染病的检测以镜检、ELISA、PCR 或胶体金技术为主［4］，一方面检测的灵敏度较低，另一方面，这些方法都是各种病原体单独检测，均难以对样本进行多因子筛检，通量低，不能满足国境口岸传染病快速筛查、诊断和预报的要求。 因此，研究更加有效的快速筛查方法，进一步提高新发传染病的检出率，对防止新发传染病通过国境口岸传入传出具有重要意义。

20 世纪70 年代发展起来的生物芯片技术是一种快速、敏感、特异、高通量并能同时检测多种病原微生物的技术平台［5］。在国境口岸，已经有利用液相芯片技术检测输入性烈性传染病［6］、蚊媒传染病［7］的方法，而在新发传染病监测领域，虽然有成熟的PCR 检测方法应用，但尚没有成熟的芯片检测技术以实现多种新发传染病的检测。 本研究利用液相芯片技术，结合了荧光定量PCR 技术的灵敏度和核酸探针技术的特异性，建立了同时检测7 种新发传染病病原体的高通量方法。

1 材料与方法

1.1 质粒

构建7 种人类传染病病原体的重组质粒：利什曼原虫质粒PMT-LSA-SSU rRNA， 寨卡病毒质粒PMT-ZIKA-NP， 人感染H7N9 禽流感病毒质粒PMT-H7N9-EP，人感染H5N1 高致病性禽流感病毒质粒PMT-H5N1-EP， 基孔肯雅病毒质粒PMTCHIKV-SPP， 中东呼吸综合征冠状病毒质粒PMTMERS-EP，西尼罗病毒PMT-WNV-NP。化学合成的寡核苷酸由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，通过PCR 的方法拼接， 并将合成好的序列克隆入P18-1 载体pMD18-T vector（Takara）。

1.2 引物和探针设计

选取GenBank 上7 种病原体的保守序列，进行序列在线分析，利用DNAStar 分别找到各基因序列中的最保守寡核苷酸序列， 用于设计反转录引物、PCR 引物及探针。 下游引物的5’端标记生物素，探针的5’端12C 标记氨基，引物和探针均由Invitrogen合成，探针及引物的序列见表1。

表1 7种病原体液相芯片检测引物和探针

1.3 多重PCR 扩增及液相芯片检测方法的建立

1.3.1 核酸抽提

所有标本均用德国Qiagen 病毒RNA 提取试剂盒及血液组织DNA 提取试剂盒抽提病原体核酸，测定浓度后备用。

1.3.2 多重反转录反应

日本TaKaRa 公司反转录反应试剂对抽提的病原休总RNA 进行反转录，反转录引物见表1。 反应体系：5×PrimeScriptTM Buffer （含dNTP Mix）2 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μl， 反转录引物组（2 μmol/L）0.5 μl，病毒总RNA 1 μg，补RNase Free ddH2O 至总体积为10 μl。 反转录：42 ℃15 min，85 ℃5 s。

1.3.3 多重PCR 扩增

1.3.3.1 混合引物工作液的制备

1.3.3.1.1 混合引物Ⅰ组

将人感染H7N9 禽流感病毒、西尼罗病毒的上、下游引物浓度比配制为1∶5。

1.3.3.1.2 混合引物Ⅱ组

将利什曼原虫、寨卡病毒、人感染H5N1 高致病性禽流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和基孔肯雅病毒的检测引物混合， 混合引物工作液中上、下游引物浓度比为1∶5。

1.3.3.2 多重PCR 扩增条件

1.3.3.2.1 PCR 反应体系Ⅰ

PCR 扩增反应总体系为20 μL， 其中包括1×PCR Buffer（with Mg2+），0.25 mmol/L dNTP，0.35 U gold Taq 酶，0.1 μmol/L 混合引物I 组（上游），0.5 μmol/L混合引物I 组（下游），CDNA 或DNA 1 μL。

1.3.3.2.2 PCR 反应体系Ⅱ

PCR 扩增反应总体积为20 μL，其中包括1×PCR Buffer（with Mg2+），0.25 mmol/L dNTP，0.35 U gold Taq酶，0.1 μmol/L 混合引物Ⅱ组（上游），0.5 μmol/L 混合引物Ⅱ组（下游），CDNA 或DNA 1 μL。

1.3.3.2.3 PCR 反应条件

94 ℃5 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃30 s，进行40 个循环；72℃10 min；10℃保温。同时设置本底对照，以水代替样品模板DNA；阳性对照以含有检测序列的DNA 作为PCR 反应模板DNA。

1.3.4 杂交及信号标记

取10 μL 多重PCR 扩增产物（反应体系Ⅰ和Ⅱ各取5 μL）、7 μL TE（pH 8.0）缓冲液和33 μL 依据美国Bio-Plex 公司微球偶联方案制备的核酸探针微球组（含12 种核酸探针，核酸探针序列见表1，每种核酸探针的微球数量约为5 000 个） 加入到同一个0.25 mL PCR 反应管中， 振荡混匀后96 ℃变性5 min，立即置55 ℃恒温杂交箱中振荡杂交30 min。杂交后的反应管中再加入100 μL SA-PE（3 μg/mL）标记试剂，振荡混匀后置50 ℃恒温杂交箱中振荡孵育20 min，使其形成微球-探针-PCR 产物-生物素-SA-PE 的复合物。

1.3.5 检测

使用Bio-Plex 200 对80 μL 杂交反应液进行测定，先对每种微球进行计数，每种微球的计数值≥50个，认为该测定结果是有效的。 再以每种病原体特异性核酸探针微球的阴性对照杂交反应所得的荧光信号平均值（MFIs）作为判断结果的背景值。 如果待检标本的MFIs 大于或等于背景值的2 倍及以上则判定为检测结果为阳性， 小于2 倍则判定为阴性［6］。

1.4 重复性、特异性实验

为了确定在PCR 反应体系I 和II 中各对引物检测结果的特异性， 将构建的利什曼原虫质粒PMT-LSA-SSU rRNA， 寨卡病毒质粒PMT-ZIKANP，人感染H7N9 禽流感病毒质粒PMT-H7N9-EP，人感染H5N1 高致病性禽流感病毒质粒PMTH5N1-EP，基孔肯雅病毒质粒PMT-CHIKV-SPP，中东呼吸综合征冠状病毒质粒PMT-MERS-EP， 西尼罗病毒质粒PMT-WNV-NP， 通过混合分别与指定引物进行扩增，产物经电泳后比对条带是否符合目的片段的大小、是否有交叉反应。 将PCR 反应体系中I、II 的扩增产物混合后与7 种基因探针偶联的相应荧光编码微球杂交，并在相同的实验条件重复测定3 次，评估所建立方法的特异性与重复性。

1.5 敏感性实验

用紫外分光光度计对制备的7 种病原体质粒DNA 进行定量，进行10 倍稀释，分别稀释成1×106DNA 拷贝、1×105DNA 拷贝、1×104DNA 拷贝、1×103DNA 拷贝、1×102DNA 拷贝、1×101DNA 拷贝、1×100DNA 拷贝。按照1.3 项的测定方法进行多重PCR 扩增及液相芯片检测。

2 结果

2.1 PCR 条件优化

为提高生物素标记产物的得率， 采用不对称PCR 方式对目的序列片段进行扩增， 当生物素修饰引物与无修饰引物间比例为5∶1 时（对应PCR 反应体系中引物的终浓度分别为0.5 μmol/L 与0.1 μmol/L），产物杂交荧光信号最强。

2.2 特异性和重复性实验

将利什曼原虫质粒PMT-LSA-SSU rRNA，寨卡病毒质粒PMT-ZIKA-NP， 人感染H7N9 禽流感病毒质粒PMT-H7N9-EP， 人感染H5N1 高致病性禽流感病毒质粒PMT-H5N1-EP， 基孔肯雅病毒质粒PMT-CHIKV-SPP， 中东呼吸综合征冠状病毒质粒PMT-MERS-EP， 西尼罗病毒质粒PMT-WNV-NP进行混合，分别与特异性引物进行扩增；经电泳显示，产物条带均符合各目的片段的大小，无非特异性扩增（见图1）。

图1 7 种病原体PCR 特异性扩增图

经PCR 反应体系I 和II 分别扩增混合质粒标本后，与微球探针组进行杂交，7 种病原体无交叉反应，所建立的液相芯片检测方法特异性较好（见表2）。 另外混合质粒标本与混合引物在相同的实验条件下重复检测3 次，各个荧光强度平均值的变异系数（CV）都在2%以内，说明该方法特异性和重复性较好（见表3）。

表2 悬浮芯片方法的检测特异性

表3 悬液芯片方法的检测重复性

2.3 敏感性实验

将7 种病原体质粒稀释10 倍浓度后，采用所建立的方法扩增、杂交，实验结果见表4，得出ZIKA、LSA、CHIKV、WNV 四种病原体的检测敏感性约为10 DNA 拷贝；MERS、H5N1、H7N9 三种病原体的检测敏感性约为100 DNA 拷贝。 结果表明阴性对照的信号相对较低， 与阳性标本的杂交信号相比差别较大，所以可以利用阴性对照的荧光信号值作为本底信号。

表4 悬浮芯片方法的检测敏感性

3 讨论

新发传染病由于其不确定性、无法预测性，使人类无法有效地开展特异性防治，导致了高死亡率［8］。针对新发传染病的检测、诊断和发现，国境口岸卫生检疫检测机构面临着重新评价传统检测手段，科学利用、发展新技术的局面［9］。基于中国国境口岸传染病排查需要和目前全球疫情防控的新要求，本研究选择了利什曼原虫、寨卡病毒、人感染H7N9 禽流感病毒、人感染H5N1 高致病性禽流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒7 种新发传染病病原体作为本次研究的重点。原因是，由于对外贸易和人员往来， 这7 种病原体非常容易引起国际间的流行和传播， 而且这些疾病均有发热等症状表现，没有实验室的检查结果很难诊断。

本研究采用液相芯片技术，结合荧光定量PCR技术的高灵敏度与核酸探针技术的高特异性，并在一个反应孔中针对7 种传染病病原体的PCR 产物进行检测，可实现对样本多靶标的同时检测。 此外，由于液相芯片是一个灵活的技术平台［10］，可采用增减扩增引物和探针交联微球适应于各种检测项目的要求；既可对大量标本进行同步检查，也可对多个病原体进行同步检测，从而提高了检查效率。 本研究建立的检测方法，由于特异性引物和针对目的片段的探针的使用， 双重提高了检测的特异性，较之传统的免疫学检测方法，消除了可能出现的抗原或抗体之间交叉反应的干扰和影响； 较之荧光PCR，增加了检测通量。 在实验中发现多重PCR 系统中西尼罗病毒的引物与其他引物共同扩增时存在互相干扰的现象，为避免其影响，将其单独扩增，两个扩增体系未见有非特异性的交叉反应。

在优化PCR 条件环节， 本研究选择了不对称PCR 的方式取代普通PCR，两者耗时相同。 但前者的主要优点在于，对相同含量的标本，不对称PCR技术可提高目的DNA 单链的产量， 可以有效降低悬液芯片在杂交时产生的互补DNA 链竞争性抑制作用，从而获得最强的产物杂交荧光信号［11］。 在检测的质量控制方面，每次检测时，先对每种微球进行计数，如果计数值≥50 个，即认为该检测结果是有效的。 此外，还通过设置阳性质粒来控制假阴性的出现，通过设置阴性对照来控制非特异性反应的出现。 因为悬液芯片检测中可能存在着不同批次实验之间的整体荧光信号值的差别，所以把阴性对照的MFIs 值作为背景信号， 荧光染料及染色时间等直接影响了该信号的大小。 在阳性域值判定时，以每次测定阴性对照MFIs 值的2 倍为结果判断的界限，很好地减少了检测过程中非特异性反应的直接影响。

本研究建立的7 种新发传染病高通量悬浮芯片检测方法，为监测和媒介生物病原体快速检测提供了一种新的技术手段，为有效防控新发传染病提供了支持。