连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落结构的差异分析

李润根, 曾慧兰, 李兴杰, 曹雨晴

连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落结构的差异分析

李润根, 曾慧兰, 李兴杰, 曹雨晴

宜春学院生命科学与资源环境学院园艺系, 江西省作物生长发育调控重点实验室, 江西宜春 336000

对连作龙牙百合(Long)与铁炮百合(Tie)根际土壤真菌ITS区进行扩增, 并利用Miseq ITS测序分析龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落的结构差异。结果表明: 测序百合根际土壤共得到69158条Clean Reads, 将其注释为277个操作分类单元(OTUs), 涵盖了5门、12纲、23目、25科、34属、36种; 在Alpha多样性指数上, Long的多样性指数高于Tie, 但均匀度低于Tie。在Beta多样性上, 两种百合间真菌群落结构差异较大; 在门水平子囊菌门、未知菌门、担子菌门为百合的优势菌群, 壶菌门为Tie特有。在属水平青霉菌属、炭疽菌属和未知菌属为两种百合真菌群落的优势菌属, 盘菌属仅出现在忌连作龙牙百合中, 青霉菌属和炭疽菌属在耐连作铁炮百合中含量增加, 未知菌属含量下降。研究表明, 连作状态下不同耐、忌连作百合根际土壤真菌群落存在差异, 且均有特异性的菌群, 研究结果为减轻或克服百合连作障碍提供一定的理论基础。

连作; 龙牙百合; 铁炮百合; 真菌群落结构

0 前言

百合(spp)是百合科百合属, 具有地下鳞茎的多年生草本植物[1]。中国百合共有48个小种和18个变种。其中铁炮百合()原产于中国台湾, 是一种重要的切花材料, 铁炮百合花朵极香, 富含芳香油, 可用于制作香料, 具有很高的观赏和经济价值[2]。龙牙百合(var)鳞茎淀粉含量高达33%—38%[3], 能够制成百合粉和百合面[4], 其鳞茎富含蛋白质、糖类和矿物质[5], 具有很好的食用和药用价值。近些年来, 随着人们对百合在食用、药用和观赏等方面的价值的认识[6], 对百合的需求量也不断的增加, 百合种植面积不断扩大和模式化的生产, 导致百合连作现象非常普遍, 严重制约了百合产业的可持续发展。根据马少兰[7]、陈丹梅[8]、袁龙刚[9]等研究发现, 长期的连作会导致土壤质量、产品产量以及病虫害严重等问题。笔者自2013年开始进行食用百合抗病育种和病害防治试验, 先后在江西万载百合基地和我校实验基地发现, 铁炮百合一次播种, 可连续生长2—3年, 土传病害轻且生长良好,表现出耐连作特性, 而龙牙百合连作则枯萎病等土传病害严重发生, 连作障碍严重。

真菌作为根际土壤微生物的重要成员, 根际土壤中的真菌与其他微生物共同参与土壤生态系统中物质的循环和能量的流动[10]。相关研究发现, 土壤微生物群落受到连作的影响, 特别是随着连作年限的增加, 真菌病原体增加和有益真菌群落的简化很可能是造成作物生长和单产下降的因素[11]。因此研究根际土壤真菌群落多样性及变化规律, 对于研究土壤可持续利用措施和保持土壤健康极其重要。本研究利用高通量测序技术对不同耐、忌连作百合品种间的真菌群落进行差异分析, 为利用生物防治来减轻百合连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年7月, 从江西省宜春市宜春学院蔬菜基地内连作相同年限的百合根际土壤中取样。按照五点取样法采集, 采集后置于无菌带内带回实验室于-80 ℃保存备用。试验地的土壤状况, 田间管理方式一致。百合品种分别为忌连作龙牙百合与耐连作铁炮百合, 分别标记为Long、Tie。

1.2 土壤根际DNA提取、扩增

龙牙百合和铁炮百合根际土壤土样微生物DNA的提取按照MP公司土壤微生物DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for soil)(MP, California, USA)的使用说明加以改进后提取[12]。提取DNA后, 用真菌ITS引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA)和ITSR2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)进行扩增, PCR正式试验采用TransGen AP221-02: TransStartFastpfu。扩增体系为20 μL, 扩增后取3 μL利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3 数据处理

根际土壤真菌多样性由上海伯豪生物技术有限公司测定。利用Illumina (Miseq)平台对Long和Tie进行ITS测序及分析.优化序列分析对Illumina平台测序所得到数据进行reads拼接, 质控过滤后, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样本得到有效序列, 然后校正序列方向, 并对测序结果进行归类操作, 采用RDP classifer叶贝斯算法在97%相似水平下将不同样本的优化序列分类, 进行OUT生物信息统计分析。稀释曲线、venn图、heatmap图等分析结果在R软件和Excel中绘制和分析。

2 结果与分析

2.1 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落OUT组成及结构

如表1所示, 在Long、Tie处理的土壤中, 共得到69158 条有效序列, 序列平均长度为295.6 bp, 其中Long和Tie真菌ITS有效序列数分别为25995、43163。本实验将相似性大于97%的Clean reads归为一个操作分类单元, 得到277 个操作分类单元(OTUs)。如图1所示,分别代表145和132种真菌(OTUs), 其中共有的0TUs数为36, Long和Tie特有的OTUs分别为109和96。说明连作龙牙百合真菌群落物种丰富度高于铁炮百合。经Silva(Release123: http://www.arb-silva.de)数据库比对, 共得到5 门、12 纲、23 目、25 科、34 属、36 种。

随机选取测序样本中的ITS读数(reads), 以真菌属(种)数(OTUs)为纵坐标, ITS读数为横坐标, 获得稀释曲线。如图2所示, 抽样读数在10000以下时, 真菌属(种)数迅速增加; 读数10000—20000之间, 真菌属(种)数缓慢增加; 读数在20000之后, 真菌属(种)数趋于平缓, 说明不同土壤样品所测的序列数能够较好地反映真菌群落种类数量, 测序数据合理。

表1 结果统计

注: 1、2代表样品重复的次数。

2.2 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌Alpha多样性分析

真菌群落的丰富度用Chao1指数和ACE指数表示, 其值越高则说明群落物种丰富度越高, 真菌群落的多样性指数用Shannon指数和Simpson指数表示, Shaonnon指数越高表明群落物种的多样性越高, Simpson指数反映了物种的优势度.根据ITS测序结果, 统计两个样品中真菌群落多样性的各项指数(表2), 结果表明, 所建立真菌文库的覆盖率均达0.99以上, 因此此结果可以真实有效地反映样本中真菌多样性。Long根际土壤中真菌Shannon、Chao高于Tie; Simpson低于Tie; Ace指数无明显差异。可见, 耐连作铁炮百合能够提高根际土壤真菌群落的优势度, 而使群落的物种丰富度降低。

图1 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落VENN图

Figure 1 Venn diagram of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar

图2 连作龙牙百合与铁炮百合根际真菌群落稀释曲线

Figure 2 The dilution curve of continuous croppingandvar

2.3 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌不同分类水平上组分分析

2.3.1 样本中菌群数在门水平上的比较

根据两种不同耐、忌连作百合根际土壤样品中的真菌群落分析发现, 在门水平上的真菌群落主要为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)和未知菌门(Other), 其中子囊菌门在门水平上是主要的优势群落, 其占比为73.04%—90.54%。如图3所示, 龙牙百合中的优势菌属(相对丰度大于1%)为子囊菌门、未知菌门; 铁炮百合的优势菌属(相对丰度大于1%)为子囊菌门、担子菌门。可以得出, 耐连作铁炮百合提高了根际土壤中子囊菌门、担子菌门和接合菌门的相对丰度, 降低了根际土壤中未知菌属的相对丰度, 且出现了一个新的门类: 壶菌门(Chytri­diomycota)。

2.3.2 样本中菌群数在属水平的比较

在属水平上为更直接地显示Long和Tie样本中真菌类群的相似性和差异, 根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息, 绘制成热图(图4)。结果表明, 龙牙百合与铁炮百合有34 属, 共有11 属, Long和Tie分别有26 属、19 属。真菌群落主要集中在青霉属、未知菌属。

表2 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌多样性指数

图3 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落在门水平上的相对丰度图

Figure 3 The relative abundances of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar at phylum level

将占比大于0.01%的归为优势菌群, 百合根际真菌群落在属水平上的优势群落为: 青霉属()、其他、盘菌属()、炭疽菌()、被孢霉属()、曲霉属()、未辨别菌属(uni­dentified)、、毛壳菌属()、杯梗孢属()、嗜热真菌属()、、节枝孢属()、嗜热链球菌属()、弯孢属()、、葡萄穗霉属()、鬼伞属()、小囊菌属()。然而在不同抗性百合中各优势菌丰度不尽相同, 其中节枝孢属(0.0288%)和(0.0144%)、小囊菌属(0.0144%)在样本间变化明显, 只在连作铁炮百合中出现, 说明耐连作铁炮百合更有利于其生长。而盘菌属(19.46%)、(0.0192%)、毛壳菌属(0.1631%)、嗜热真菌属(0.0815%)、弯孢属(0.0336%)、葡萄穗霉属(0.0144%)只出现在龙牙百合中。耐连作铁炮百合提高了根际土壤青霉菌属和炭疽菌属、、被孢霉属的相对丰度, 降低了其他、曲霉属、肉座菌属、未辨别菌属、杯梗孢属、嗜热链球菌属的相对丰度.通过分析发现, 在属水平上的主要优势菌落的分布于纲水平基本一致, 最为重要的菌群是青霉菌属(48.94%—86.43%)、未知菌属(11.34%—29.02%)、盘菌属(19.46%)和炭疽菌属(1.669%—1.837%)。此外, 引起百合病害中最普遍、最严重的枯萎病病原菌镰刀菌属也在龙牙百合中检出, 但其相对丰度较低(<0.01%)。

2.4 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落Beta多样性分析

基于OUT的连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)如图5所示, PC1和PC2分别表示不同群落间55.97%和28.23%的变异差异度, 两者累计贡献率达84.2%, 解释了大部分变量, 比较具有代表性.PC1和PC2将Long和Tie明显区分开来, 位于图5中的不同位置并且两者的距离较远, Long位于第三象限, Tie位于第二象限, 说明不同耐、忌连作百合对根际土壤真菌群落结构影响较大。

图4 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落在属水平上的HEATMAP图

Figure 4 Heatmap of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar at genus level

图5 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落PCA分析图

Figure 5 PCA analysis of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar

3 讨论与结论

大量研究显示, 相同植物的不同品种间根际微生物在数量和组成上存在着一定的差异[13-14]。本研究结果表明, 铁炮百合降低了根际土壤真菌群落的多样性提高了特异性物种的优势度, 这一结果与田晴[15]、杨光柱[16]、周阳[17]等研究结果相似, 在有利于作物生长条件下能使真菌总数量和多样性指数降低。

基于高通量测序技术分析发现, 在门水平上, 百合根际土壤中的优势菌群为子囊菌门、担子菌门和未知菌门, 其中子囊菌门在根际真菌群落中占绝对优势, 且在耐连作铁炮百合中出现了特异性真菌群落: 壶菌门, 这与前人研究西瓜[15]、苹果[16]、水稻[17]、柑橘[18]研究结果一致。

在属水平上, 连作铁炮百合提高了青霉菌属、炭疽菌属和被孢霉属的含量, 而降低了曲霉属的含量。青霉属在龙牙百合和铁炮百合中占比为48.94%、86.43%, 是连作百合中的最优菌属, 而对百合影响最严重的镰刀属的相对丰度较低, 且在耐连作铁炮百合中未检测出, 这可能与青霉属能抑制镰刀属的生长有关[19], 也可能与试验地长期使用农药有关, 这一结果也与StraathofT P[20]和李润根[21]等研究表明铁炮百合比龙牙百合更抗枯萎病的结果一致。但青霉属中扩展青霉也能引起百合青霉病, 仇硕[22]通过SA、JA等生长调节物质提高了龙牙百合抵抗青霉病的能力。另一种优势菌属为炭疽菌属, 能引起百合炭疽病且在江西各产地均有发生[23], 本研究中, 耐连作铁炮百合炭疽菌属的相对丰度比龙牙百合高0.17%, 这一结果与唐祥宁[24]研究一致。根据木霉菌可寄生炭疽菌属这一生物学特性[25], 可选取木霉菌作为生防菌来减轻百合的连作障碍, 但如何通过木霉菌来防制百合病害还需要进一步研究。铁炮百合中曲霉属的含量比龙牙百合降低了0.024%, 使铁炮百合在百合曲霉病方面抗性比龙牙百合强[24]。被孢霉属属于接合菌门被孢霉科, 它能利用土壤中的糖分以及通过利用多糖物质生长代谢分解纤维素、半纤维素, 提高土壤中含碳养分和有机质的含量, 还具有分解土壤中磷的功能, 因此它被认为是土壤中的有益微生物, 被孢霉属在两种百合中都存在, 但在铁炮百合中含量较高。

另外, 节枝孢属、小囊菌属和角担菌属为铁炮百合特有菌属。根据闫凝星等[26]对节枝孢属的次级代谢产物分析发现它能够抑制稻瘟霉并且有较好地细胞毒活性和较强的抗氧化活性; 小囊菌属是一种粘细菌, 它具有抗真菌的特性[27]; 角担菌属中含有蓝莓[28]、兰花[29]的菌根真菌和植物土传病害的生防菌[30], 菌根可以提高植物吸收水分和养分的能力[31], 它不仅提高了植物的抗病性和土壤适应性促进植物的生长, 而且还改善了土壤的理化性质[32]。以上分析结果都显示, 铁炮百合耐连作而龙牙百合忌连作。

忌连作龙牙百合中存在一些特有的病原菌属, 如弯孢属[33]、葡萄穗霉属[34], 但同时也含有一些特有的生防菌, 如毛壳菌属[35], 毛壳菌属具有降解纤维素的能力, 被广泛应用于植物病原体的生物防治, 这可能与土壤微生态系统应答病原菌有关, 更多的病原菌刺激了更多的青霉属和毛壳菌属的出现, 然而这些生防菌对克服百合病害病原菌的效果还需要进一步研究。

总之, 在连作相同年限的情况下, 耐连作铁炮百合与忌连作龙牙百合根际土壤真菌群落存在差异, 与耐连作铁炮百合相比, 忌连作龙牙百合的根际土壤真菌群落多样性提高, 一些病原菌微小的变化可能也会使真菌种群失去平衡, 进而导致龙牙百合易感染病害。此外, 连作百合根际土壤中也存在青霉属、毛壳菌属等具有生防潜能的真菌, 但是如何利用这些生防菌来解决百合的连作障碍还需要进一步的研究。

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Differences of rhizosphere soil fungi betweenvar andin continuous cropping

LI Rungen, ZENG Huilan, LI Xingjie, CAO Yuqing

Jiangxi Key Laboratory of Crop Growth Regulation/College of Life Science Environment and Resource, Yichun University, Yichun 336000, Jiangxi, China

The ITS regions of rhizosphere soil fungi in the continuous crops ofvar(Long) and(Tie) were amplified, and Miseq ITS sequencing was used to analyze the structural differences of the rhizosphere soil fungal communities invarand. The results show that a total of 69158 clean reads are obtained by sequencing lily rhizosphere soil and annotated as 277 operational taxonomic units (OTUs), covering 5 phylums, 12 classes, 23 orders, 25 families, 34 genus, 36 species. In the Alpha diversity index, Long diversity index is higher than Tie, but the uniformity is lower than Tie. In Beta diversity, the fungal community structure between the two lilies is quite different. At the phylum level, the predominant flora of lily is Ascomycota, Unknown and Basidiomycota, Chytridiomycota is unique to Tie. At the genus level, Penicillium, Colletotrichum and Unknown fungi are the dominant genus of two lilies, and Peziza only appears in botanicvar, the content of Penicillium and Colletotrichum is increased in resistant to the, and the content of unknown fungal declines.There are differences in rhizosphere soil fungal communities of different tolerant, bogey continuous lilies under continuous cropping, and all of them have specific flora. The results provide a theoretical basis for reducing or overcoming the obstacles of lily continuous cropping.

continuous cropping;var;; fungal community structure

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.04.022

S154.36

A

1008-8873(2022)04-189-07

2020-06-18;

2020-09-02

江西省科技计划项目(20161BBF60040); 江西省教育厅科技计划项目(160132)

李润根(1966—), 男, 江西新余人, 教授, 主要从事蔬菜栽培及克服连作障碍技术研究, E-mail: 13507058200@163.com

李润根, 曾慧兰, 李兴杰, 等. 连作龙牙百合与铁炮百合根际土壤真菌群落结构的差异分析[J]. 生态科学, 2022, 41(4): 189–195.

LI Rungen, ZENG Huilan, LI Xingjie, et al. Differences of rhizosphere soil fungi betweenandin continuous cropping[J]. Ecological Science, 2022, 41(4): 189–195.