UHPLC-ESI-Q-TOF-MS快速分析荭草中化学成分

李 容 杨淑婷 潘 洁 刘春花 陆 苑 王永林 孙 佳*

1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；3. 贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004

荭草为蓼科植物荭草PolygonumorientaleL. 的干燥果穗及带叶茎枝，收载于2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有活血、消积、止痛的功效,用于治疗风湿性关节炎、痢疾、疮肿等，贵州省民间常用于治疗胸痛、胸闷、中风偏瘫(嘴角歪斜)等疾病[1-3]。国内外研究报道[4-9]表明黄酮类、木质素类、甾体皂苷类、二苯乙烯类等为荭草药材中的主要化学成分，其具有抗急性心肌缺血、扩张血管、抗菌、抗血栓、抗肿瘤等多种药理活性，课题组在药理筛选实验中发现荭草水溶性部位具有较好的抗心肌缺血和抗缺氧作用，其中含量较高的黄酮类和酚酸类为荭草抗心肌缺血作用的主要活性成分[10]。因此，有必要对荭草中化学成分进行深入研究。近年来，荭草的研究工作主要集中在化学成分的分离鉴定、含量测定及药理作用等方面，使用液相色谱-质谱联用技术进行荭草化学成分鉴别的报道较少，其中黄勇等[11]采用高效液相色谱-低分辨质谱的方法鉴别得到了荭草中的 12个成分。

超高压液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱(UHPLC-ESI-Q-TOF-MS)技术，用于化学成分快速分析鉴定，具有快速高效、质量范围宽、离子传输效率高、分辨率高及灵敏度高等特点，目前已经越来越多地应用于天然产物及复方多成分的结构鉴定[12-14]。本实验采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS联用技术，以荭草为研究对象，对荭草提取物的化学成分进行研究，通过结合对照品、查阅相关文献及相关质谱数据，对荭草提取物中化学成分进行结构分析，根据准分子离子以及二级碎片离子，总结其质谱裂解规律，为荭草的化学成分快速鉴定和下一步研究开发控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ESI-Q-TOF-MS(布鲁克道尔顿电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪，包括Metabolite ToolsTM、MDF技术等)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统(配有1290 Infinity二元泵，高性能自动进样器，二级管阵列检测器，柱温箱)；Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

1.2 试药 荭草素、异荭草素、牡荆素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为：wkq16041301、wpk16080404、wkq16031003)。乙腈(德国Merck 公司，色谱纯)；甲酸(美国TEDIA有限公司，色谱纯)；纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；其他试剂均为分析纯。

荭草药材购买自贵州省六盘水、贵州省盘州市、贵州省贵阳市药用植物园种植基地，由贵州医科大学龙庆德副教授鉴定为蓼科植物荭草(PolygonumorientaleL.)的干燥全草。标本存于贵州省中药民族药研究开发中心。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 称取荭草药材1.2 g，加入70%乙醇50 mL加热回流提取4 h，过滤，合并滤液，15000 r/min 离心5 min 取上清液，即得供试品。

2.2 标准溶液的制备 分别精密称取荭草素、异荭草素、牧荆素各20 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度处，摇匀。配制成质量浓度为2 mg/mL的混合对照品溶液，用甲醇稀释至浓度为0.5 mg/mL浓度，4 ℃储存备用。

2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱温：45 ℃，流动相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脱(0～5 min，95%～95% A；5～15 min，95%～85% A；15～25 min，85%～75% A；25～30 min，75%～95% A，30～32 min，95%～95% A，32～34 min，95%～5% A)，流速：0.25 mL/min，柱温：25 ℃，进样量：2 μL。

2.4 质谱条件 电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛细管电压(正离子模式4 kV, 负离子模式3.5 kV)，锥孔电压：80 V，离子源温度：110 ℃，雾化气：N2，压力：1.3 bar，流速：6.0 L /min，温度180 ℃，脱溶剂气温度：300 ℃，气体体积流量：50 L/h，脱溶剂气体积流量：550 L/h，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic，数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM (包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)软件、质量亏损过滤(MDF)。

3 结果

利用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS对其中化学成分进行检测分析，(+)ESI-MS的质谱总离子流图(TIC)如图1所示。由图1可以看出荭草样品在正模式下共同的39个色谱峰，分离较好。通过Data Analysis软件得到70%甲醇提取的荭草中各化学成分的保留时间及其质谱信息，结合基峰图与对照品和相关文献所报道的数据进行对比，对其中的化学成分进行了推测确认，初步从荭草提取物中鉴定了21个化学成分，其中异荭草素、荭草素、牡荆素与对照品比对确认，木犀草素、芦丁、异鼠李素等与相关文献比对确认，相关数据见表1。

图1 荭草ESI+模式TIC图

表1 荭草中化学成分分析

续表1 表1 荭草中化学成分分析

3.1 荭草化学成分的鉴定 化合物4：在tR3.6 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 449.0935，保留时间和二级碎片离子与对照品一致(图2)，二级图谱碎片离子为m/z 395.0707、353.0654、329.0675、299.0464、182.1656、102.6239，分别对应[M+H-3H2O]+、[M+H-CH8O2]+、[M + H-120]+为[M+H]+失去一个质量数为120的中性粒子，产生的一个在葡萄糖基上2位和 O 位断裂所得到的碎片离子、[M+H-150]+为[M+H]+失去一个质量数为150的中性粒子，产生一个在葡萄糖基上1位和 O 位断裂所得到的碎片离子，工作站推测其分子式为C21H20O11(err 6.6 ppm)，因此根据保留时间和二级碎片离子确定为异荭草素。

图2 异荭草素的质谱图

化合物5：在tR4.0 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 449.1254，保留时间和二级碎片离子与对照品一致(图3)，二级图谱碎片离子为m/z 413.0957、383.0682、329.0606、299.0578、259.0608、211.3284、142.7938、73.6635,分别对应[M+H-H2O]+、[M+H-CH6O2]+、[M+H-120]+为[M+H]+失去1个120为质量数的中性粒子，产生的1个在葡萄糖基上2位和 O 位断裂所得到的碎片离子、[M + H-150]+为[M+H]+失去1个质量数为150的中性粒子，产生1个在葡萄糖基上1位和 O 位断裂所得到的碎片离子，工作站推测其分子式为C21H20O11(err 8.3 ppm)，因此根据保留时间和二级碎片离子确定为荭草素。

图3 荭草素的质谱图谱

化合物8：在tR 5.5 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 433.1131，保留时间和二级碎片离子与对照品一致(图4)，二级图谱碎片离子为m/z 397.0932、337.0842、313.0719、283.0644、235.0394、76.0835,分别对应[M+H-2H2O]+、[M+H-C2H4O2]+、[M+H-120]+为[M+H]+失去1个质量数为120的中性粒子，产生的1个在葡萄糖基上2位和 O 位断裂所得到的碎片离子、[M+H-150]+为[M+H]+失去1个质量数为150的中性粒子，产生1个在葡萄糖基上1位和 O 位断裂所得到的碎片离子，工作站推测其分子式为C21H20O10(err 5.3 ppm)，因此根据保留时间和二级碎片离子确定为牡荆素。

图4 牡荆素的质谱图谱

化合物12：在tR8.9 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 449.1838，二级图谱碎片离子为m/z 382.9297、287.0717、212.1996、156.4139，工作站推测其分子式为C21H20O11(err 10.2 ppm)，根据二级碎片287.0717、212.1996、156.4139，推测为山柰素母核，而且碎片287.0717、156.4139的强度明显高于其他碎片离子，可以推测糖连接在3位上(图5)，结合参考文献[19],推测此化合物为山柰素-葡萄糖苷。

图5 山柰素-葡萄糖苷的质谱图谱和裂解规律

化合物13：在tR9.1 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 449.1045，二级图谱碎片离子为m/z 303.04473、249.0269、179.3563、153.2378、140.2155、119.7527、78.6479，工作站推测其分子式为C21H20O11(err 7.5 ppm)，根据二级碎片303.04473、249.0269、179.3563、153.2378，推测为槲皮素母核，而且碎片303.0447、179.3563、153.2378的强度明显高于其他碎片离子，可以推测糖连接在3位上(图6)，结合参考文献[16],推测此化合物为槲皮苷。

图6 槲皮素的质谱图谱和裂解规律

化合物20：在tR19.7 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 287.0476，二级图谱碎片离子为m/z 243.1033、177.0675、153.1243，工作站推测其分子式为C15H11O6(err 2.8 ppm)，二级碎片m/z 243.1033、177.0675、153.1243，分别对应[M + H-CO2]+、[M + H-C5H2O3]+、[M+H-C8H6O2]+(图7)，结合参考文献[21],推测此化合物为木犀草素。

图7 木犀草素的裂解规律图

化合物24：在tR21.8 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 611.1770，二级图谱碎片离子为m/z 465.1110、303.0145、257.4031、229.1231、153.1529，工作站推测其分子式为C27H30O16(err -2.4 ppm)，二级碎片m/z 465.1110、303.0145、257.4031、229.1231、153.152943，分别对应[M+H-C6H6O5]+、[M+H-C12H4O10]+、[M+H-C13H6O12]+、[M+H-C14H6O13]+、[M+H-C20H22O13]+，结合参考文献[8],推测此化合物为芦丁。

化合物31：在tR25.2 min时，正离子模式下得到准分子离子峰[M+H]+m/z 317.0647，二级图谱碎片离子为m/z302.2121、273.1976、，工作站推测其分子式为C16H12O7(err 2.7 ppm)，二级碎片m/z 302.2121、273.1976，分别对应[M + H-CH3]+、[M + H-CH3O]+，结合参考文献[13]，推测此化合物为异鼠李素。

4 讨论

荭草70% 乙醇提取物中大部分化合物采用本实验建立的UHPLC方法能得到较好的分离，流动相中加入0.1%的甲酸有利于改善峰型。本实验采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS方法从荭草提取物中分析得到了39个化学成分，运用Data Analysis分析软件，采用高分辨质谱精确质量和同位素峰型匹配来初步确定化合物的分子式，通过与对照品比对，确定其中3个化学成分，同时参考相关文献信息，推测了19个化学成分。另外，因为提取物中存在着大量结构类似的同分异构体，不但分子式一样，并且有相似的裂解方式，例如异荭草素和荭草素，区分它们需要用对照品进一步确认，本实验也用相应的对照品对同分异构体进行对比。当然，荭草提取物中还存在很多其他的化合物，而且大多数是属于同一类化合物，彼此的区别不明显，且二级碎片离子的信息相似，其结构有待进一步研究。

木犀草素及其黄酮苷广泛存在于抗炎植物原料中，具有广泛生理活性[22]。Cottiglia等[23]发现从亚麻叶瑞香中提取的异荭草素，可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌等的生长。郑必胜等[24]研究表明从忍冬叶片中提取的木犀草素具有较强的抗氧化活性。胡琪琪等[25]发现荭草醋酸乙酯提取物中含量较高的异荭草素、荭草素、牡荆素等黄酮类化合物分是其抗肿瘤的主要活性成分。实验采用的UHPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能快速分析中药提取物中的化学成分，为民族药荭草成分的全面定性分析提供了一种高效、快速的分析方法，并为微量成分的快速分析提供了一种科学有效的分析方法。