有机酸在三华李发酵过程中对花色苷的护色作用分析

李 媛，郭卓钊，沈雪玉，施奕乔，黄 苇,*

（1.广东康辉集团有限公司，广东 潮州 515638；2.广东正一品生物科技股份有限公司，广东 潮州 515638；3.华南农业大学，广东 广州 510642）

传统广式凉果生产通常将鲜果添加约占鲜果质量25%的食盐及1%的焦亚硫酸钠一次性腌制为果坯，为产品周年生产提供半成品原料。但该法会使李果中的花色苷大部分损失，使用不当还会导致产品二氧化硫残留量超标，引发食品安全问题，另外，高盐腌制液的排放还会导致环境污染和资源浪费。三华李果肉的紫红色主要由花色苷所呈现，花色苷是一种安全、无毒的天然色素，具有抗氧化，预防糖尿病，保护视力，抗动脉粥样硬化，防治心血管疾病和抑制血小板凝集等生物活性功能[1-2]。过量使用亚硫酸盐会导致三华李果中的天然色素花色苷严重破坏，营养价值和感官品质降低[3-4]。利用乳酸菌发酵取代高硫、高盐腌制果坯，能达到无硫保藏果坯的目的，并大幅度降低食盐使用量[5-6]，充分保障产品品质及安全。乳酸菌发酵过程中，会产生芳香类烷烃、醇酯类、烯烃类等物质，赋予发酵后的果蔬坚果香、花香等风味[7-8]。相关研究报道，pH值较低时，花色苷以稳定的黄酮型结构为主，当pH值升高，不稳定的查耳酮型假碱、甲醇和醌型比例将增加[9-10]。乳酸菌发酵过程中，因早期产酸有限，不能达到很好的护色效果。在接种发酵开始时，适当添加有机酸可以降低发酵体系的pH值，使花色苷酰基化，有利于维持花色苷的稳定。本文以三华李为原料，通过有机酸在发酵过程中对果坯的护色效果，优选其复配配方，为高花色苷含量三华李果坯的发酵提供依据，从而为开发高品质三华李产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

三华李鲜果，购于天平架水果批发市场。

孟加拉红培养基、MRS培养基，广州环凯生物科技有限公司；草酸，广州化学试剂厂；柠檬酸，天津富晨化学试剂厂；迷迭香酸，上海麦克林生化科技有限公司；醋酸，天津市富宇精细化工有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

TU-1800紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XK97-A菌落计数器，闽测仪器设备（厦门）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验设计

参照前期试验[11-12]，按李果质量计，添加180%水、3.3%糖、0.025%山梨酸钾、0.01%那他霉素、3.00%食盐，接种复配乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌∶肠膜明串珠菌=3∶1∶8），草酸、柠檬酸、迷迭香酸、醋酸均按李果质量的0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%分别单独进行添加，封口后37℃储藏发酵，定期测定花色苷、致腐菌指标。文中配方百分比均为质量分数。

1.2.2 响应面法优化复配护色剂配方

在发酵体系中，根据单因素试验结果，选取0.2%迷迭香酸、0.4%草酸、0.4%柠檬酸作为中心试验点，以发酵后果坯花色苷含量下降率（Y）为响应值，采用响应面试验法优化复配护色剂，因素水平编码如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test 单位：%

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 乳酸菌总数、霉菌和酵母总数

参照GB 4789.15—2016[13]中规定的方法进行测定。

1.2.3.2 果坯花色苷含量

参照陈云霞等[14]和杨磊等[15]的方法并稍作修改。果坯打浆后充分混匀并准确称取5.00 g，加入用36%的盐酸调定pH值为3的酸性乙醇20 mL，浸提20 h，超声处理20 min后抽滤，滤液用酸性乙醇定容至50 mL，利用紫外可见分光光度计测定OD520值，通过吸光度计算花色苷含量，计算公式为：

式中：A为实测试样的吸光度值；V为液体总体积，mL；m为试样质量，g；98.2为花色苷平均消光系数。

1.2.3.3 花色苷下降率

花色苷下降率按以下公式计算：

式中：A为发酵30 d后果坯花色苷含量，mg/100 g；A0为新鲜三华李花色苷含量，mg/100 g。

1.2.4 数据处理

单因素试验数据使用SPSS 18.0软件进行显著性分析；响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 有机酸护色剂的筛选

黄月[16]从三华李鲜果分离出的致腐菌主要为汉逊德巴利氏酵母、巴斯德毕赤酵母、胶红酵母以及枝孢霉菌。黄志钰等[17]从三华李发酵液中分离出的致腐菌主要为假丝酵母亚种、库德里阿兹氏毕赤酵母和西方毕赤酵母。因此监测三华李发酵过程中霉菌和酵母的活菌数十分重要。

2.1.1 草酸添加量对三华李果坯发酵效果的影响

由图1可知，新鲜三华李花色苷含量平均为3.11 mg/100 g，在相同发酵时间内，三华李果坯花色苷含量随草酸添加量的增加而升高。

图1 草酸添加量对发酵过程中三华李果坯花色苷含量的影响Fig.1 Effects of oxalic acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

草酸添加量与发酵过程中三华李果坯微生物生长状况关系见图2及图3。由图2可知，发酵第5天开始，所有草酸处理组乳酸菌活菌数均大幅度下降，发酵至第15天时，仅检测出少量乳酸活菌，至第30天，已检测不出乳酸活菌。霉菌和酵母在第15天时就基本检测不出（图3）。在相同发酵时间内，总活菌数随草酸添加量的增加而减小，说明草酸对微生物的生长有一定的抑制作用。

图2 草酸添加量对发酵过程中三华李果坯乳酸菌总数的影响Fig.2 Effects of oxalic acid additions on total numbers of lactic acid bacteria in Sanhua plum fruit billets during fermentation

图3 草酸添加量对发酵过程中三华李果坯霉菌和酵母总数的影响Fig.3 Effects of oxalic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

综上可知，草酸添加量越高，相同发酵时间内果坯花色苷降解越缓慢，微生物存活率降低。结合发酵效果及护色效果，选择草酸添加量0.2%为适宜发酵浓度。

2.1.2 柠檬酸添加量对三华李果坯发酵效果的影响

由图4可知，在相同发酵时间内，三华李果坯花色苷含量随柠檬酸添加量的增加而升高。

图4 柠檬酸添加量对发酵过程中三华李果坯花色苷含量的影响Fig.4 Effects of citric acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

柠檬酸添加量与发酵过程中三华李果坯微生物生长状况关系见图5及图6。由图5可知，所有柠檬酸处理组的乳酸菌活菌数均随发酵时间的延长而减少，至第30天时，基本检测不出乳酸活菌；相同发酵时间内，霉菌和酵母总数随柠檬酸添加量的增加而减小。

图5 柠檬酸添加量对发酵过程中三华李果坯乳酸菌总数的影响Fig.5 Effects of citric acid additions on total number of lactic acid bacteria in Sanhua plum fruit billets during fermentation

图6 柠檬酸添加量对发酵过程中三华李果坯霉菌和酵母总数的影响Fig.6 Effects of citric acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

综上所述，随着柠檬酸添加量的升高，发酵三华李果坯花色苷降解速度延缓，微生物存活率降低。为兼顾发酵效果及护色效果，选择柠檬酸添加量0.4%为适宜发酵浓度。

2.1.3 迷迭香酸添加量对三华李果坯发酵效果的影响

由图7可知，在相同发酵时间内，三华李果坯花色苷含量随迷迭香酸添加量的增加而升高。

图7 迷迭香酸添加量对发酵过程中三华李果坯花色苷含量的影响Fig.7 Effects of rosmarinic acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

迷迭香酸添加量与发酵过程中三华李果坯微生物生长关系见图8和图9。由图8可知，相同发酵时间内，乳酸菌活菌数随迷迭香酸添加量的增加逐渐减小，0.8%迷迭香酸处理组在发酵第30天时基本检测不出乳酸活菌，其他试验组可以维持一定的乳酸菌活菌数。由图9可知，迷迭香酸处理组的霉菌和酵母总数在标准时间范围有小幅度增长，中后期逐渐减少，相同发酵时间内，数量随迷迭香酸添加量的增加而减小。

图8 迷迭香酸添加量对发酵过程中三华李果坯乳酸菌总数的影响Fig.8 Effects of rosmarinic acid additions on total numbers of lactobacillus in Sanhua plum fruit billets during fermentation

图9 迷迭香酸添加量对发酵过程中三华李果坯霉菌和酵母总数的影响Fig.9 Effects of rosmarinic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

综上所述，随着迷迭香酸添加量的升高，发酵三华李果坯花色苷降解速度延缓，微生物存活率降低，对果坯风味影响增大，虽然迷迭香酸具有优秀的护色效果，但其添加过多，自身所带来的气味会掩盖果香味，为兼顾发酵效果、护色效果及果坯风味，选择迷迭香酸添加量0.2%为适宜发酵浓度。

2.1.4 醋酸添加量对三华李果坯发酵效果的影响

由图10可知，醋酸添加量低于0.4%时，对果坯花色苷降解有一定抑制作用；醋酸添加量大于0.4%时，相同发酵时间内，果坯花色苷含量随添加量增加而减小，且均低于对照，不利于护色。

图10 醋酸添加量对发酵过程中三华李果坯花色苷含量的影响Fig.10 Effects of acetic acid additions on anthocyanins contents in in Sanhua plum fruit billets during fermentation

醋酸添加量与发酵过程中三华李果坯微生物生长关系见图11和图12。由图11可知，低添加量的醋酸处理组在发酵初期，乳酸菌活菌数呈增长趋势。由图12可知，发酵至第30天时，随着醋酸添加量的增加，霉菌和酵母生长受抑制的程度增加。研究表明，与醋酸发酵过程相关的细菌为乳杆菌属[18]，适量添加醋酸有助于降低发酵液的酸度，抑制腐败菌生长的同时不会对乳酸菌产生不利影响。

图11 醋酸添加量对发酵过程中三华李果坯乳酸菌总数的影响Fig.11 Effects of acetic acid additions on total numbers of lactobacillus in Sanhua plum fruit billets during fermentation

图12 醋酸添加量对发酵过程中三华李果坯霉菌和酵母总数的影响Fig.12 Effects of acetic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

醋酸添加量过多，强烈的醋酸刺激气味会掩盖部分原果的风味，对后续产品的调味加工带来不利影响。

综上所述，醋酸添加量越高，致腐菌存活率越低，添加0.4%醋酸发酵30 d时果坯花色苷含量最高，低浓度醋酸对延缓果坯花色苷降解有一定作用，但高浓度醋酸反而加速其降解。故选择醋酸添加量0.4%为适宜发酵浓度。

2.2 不同有机酸护色能力比较

由表2及图13可知，发酵过程中，添加草酸、柠檬酸、迷迭香酸对抑制花色苷的降解均呈明显的量效关系，添加量越大，其对三华李果坯的护色效果越好。但添加醋酸时，在低浓度范围内对花色苷降解具有一定地延缓作用，添加量达到0.6%以上时反而促进果坯花色苷的降解。这可能是因为醋酸对腐败菌的抑制效果较弱，果坯软化程度较高，加速花色苷溶出到发酵液中。添加量在0~0.4%范围内，迷迭香酸与草酸护色能力相当；当添加量大于0.6%时，不同有机酸护色能力由强到弱依次为：迷迭香酸＞草酸＞柠檬酸＞醋酸。赵磊等[19]关于提高黑米花色苷颜色稳定性辅色剂的研究表明，迷迭香酸和草酸会使花色苷溶液出现增色效应，但草酸会使花色苷溶液出现蓝移现象，迷迭香酸护色效果优于草酸，因为迷迭香酸通过氢键和π-π堆积的相互作用力与花色苷结合，从而提高黑米花色苷的稳定性。

图13 不同有机酸对发酵三华李果坯的护色效果（发酵30 d）Fig.13 Color protection effects of different organic acids on fermented Sanhua plum fruit billets(30 d fermentation)

表2 添加不同有机酸发酵30 d时三华李果坯花色苷含量Table 2 Anthocyanin contents of Sanhua plum fruit billets after 30 d fermentation with different organic acids additions 单位：mg/100 g

有机酸一般结合在花色苷的C3位或C6位糖基上，形成酰化花色苷，其可折叠糖链将有机酸置于2-苯基苯并吡喃骨架表面，能较好地抵抗水的亲核攻击，从而增加花色苷稳定性[20]。有机酸提供的酸性环境能使花色苷分子聚合成非共价手性超分子复合物，形成了一个花色苷颜色的核心，加强自聚作用，阻止水合作用，加深花色苷颜色[21]。

一般随着有机酸分子中甲氧基和羟基数的增加，花色苷酰化效果增加，花色苷的稳定性随之提高[22]。由4种有机酸结构图（图14）可以看出，分子中甲氧基和羟基数量由高到低依次为：迷迭香酸＞柠檬酸＞草酸＞醋酸。研究发现，草酸抑制鲜切香蕉褐变的效果均好于柠檬酸[23]。可能是因为草酸除了对花色苷进行酰基化作用外，还有较强的抑制多酚氧化酶（PPO）的能力，抑制同属酚类物质的花色苷褐变，使得护色效果优于柠檬酸，但其机理还有待进一步的研究。

图14 不同有机酸结构图Fig.14 Structure diagrams of different organic acids

2.3 响应面法优化护色剂配方

2.3.1 响应面试验设计与结果

以花色苷下降率为指标，进行复配护色剂的响应面优化试验。响应面试验设计与结果见表3。

表3 复配护色剂优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface optimization test for compound color protectors

利用Design-Expert 8.0.6统计软件对响应面试验数据进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

以花色苷下降率Y为响应值，迷迭香酸X1、草酸X2、柠檬酸X3为自变量，建立二次回归方程：

Y=34.81-2.07X1+1.33X2-0.913X3-1.19X1X2+0.3X1X3-1.56X2X3+0.5X12+0.6X22+1.66X32

由表4可知，模型极显著（P=0.001 7＜0.01）；失拟项不显著（P=0.472 2＞0.05），说明该模型残差均由随机误差引起；决定系数R2=0.939 3，调整决定系数=0.861 3，说明二次回归方程拟合程度高，能够反映三华李发酵前后果坯花色苷变化率情况。

由图15~16可知，相对于迷迭香酸和草酸（X1X2）的交互作用，草酸和柠檬酸（X2X3）的交互作用对发酵果坯花色苷下降率的影响更为显著，柠檬酸浓度越低且草酸浓度越高，对发酵果坯花色苷的下降率影响越显著。

图15 迷迭香酸和草酸添加量的交互作用对花色苷下降率影响的响应面图和等高线图Fig.15 Response surface diagram and contour plot of interaction effects between rosmarinic acid and oxalic acid additions on anthocyanin decline rates

以花色苷下降率最小为最优结果，通过响应面分析得到各因子的优化参数为：迷迭香酸添加量0.3%，草酸添加量0.4%，柠檬酸添加量0.4%，发酵后果坯花色苷下降率预测值为33.48%。

在该优化条件下进行验证试验，测得花色苷下降率为32.80%，与理论值基本吻合，说明该模型能较好地预测上述复配护色剂的护色效果。

图16 草酸和柠檬酸添加量的交互作用对花色苷下降率影响的响应面图和等高线图Fig.16 Response surface diagram and contour plot of interaction effects between oxalic acid and citric acid additions on anthocyanin decline rates

2.3.2 复配护色剂对发酵三华李果坯色泽影响直观效果的比较

由图17可知，CK组三华李果坯颜色相对暗沉，添加最佳复配护色剂的果坯色泽红艳，CK组发酵果坯花色苷含量为1.36 mg/100 g；添加最佳复配护色剂组的花色苷含量为2.09 mg/100 g，与鲜果平均花色苷含量3.11 mg/100 g相比较，下降率为32.80%，相比未进行护色处理的空白对照组，花色苷下降率降低了23个百分点，护色效果显著。果坯无明显的迷迭香残留气味，有典型三华李果香以及发酵的醇香。

图17 复配护色剂对发酵果坯色泽的影响Fig.17 Effects of compound color protectors on the color of fermented fruit billets

添加优选的有机酸复配护色剂，经接种37℃发酵30 d，每毫升霉菌和酵母总数对数值均在1左右，乳酸菌活菌数均在2以上，符合保藏要求。

3 结论

（1）通过在乳酸菌发酵体系中加入有机酸护色剂能有效保护花色苷，迷迭香酸、草酸、柠檬酸3种有机酸添加量越大，三华李果坯花色苷降解量越小；发酵30 d时，在添加量0.2%~0.4%范围内，草酸护色能力略优于迷迭香酸，添加量0.6%~08%范围内，迷迭香酸护色能力优于草酸，总体比较护色能力由强到弱依次为：迷迭香酸＞草酸＞柠檬酸＞醋酸。添加有机酸能有效抑制霉菌和酵母的生长。

（2）在发酵体系中加入复配护色剂（0.3%迷迭香酸，0.4%草酸，0.4%柠檬酸），37℃乳酸菌发酵30 d时，三华李果坯花色苷为2.09 mg/100 g，相比鲜果（3.11 mg/100 g），花色苷含量下降率为32.80%，CK组发酵果坯花色苷含量为1.36 mg/100 g，花色苷下降率为56.27%。以上结果说明，有机酸护色剂对三华李果坯花色苷的保护作用显著。