添加高温期堆料对青藏高原羊粪堆肥有机成分降解及酶活性的影响

蔡 瑞，张 帅，崔欣雨，徐春城

(中国农业大学工学院，北京 100083)

近些年，随着青藏高原地区畜牧业集约化发展的不断推进，规模化牧场数量快速增加，产生和积累了大量的畜禽废弃物。特别是在冬季集中圈养情况下，这些畜禽废弃物如果不及时处理，会严重污染土壤、地下水及空气等自然环境，破坏牧场周边地区的生态环境，并威胁人和动物的健康[1]。好氧堆肥是将畜禽粪便转化为优质有机肥料的有效途径，是实现畜禽粪便无害化和资源化利用的重要方式[2]。然而，青藏地区高寒、氧气稀薄以及空气干燥等特殊气候条件会造成该地区堆肥发酵缓慢，甚至无法进行，因此全年适合大规模堆肥的时间十分有限，在有限的时间内将大量的畜禽粪便变成高质量的有机肥对该地区化肥农药减量增效行动、农牧业绿色发展和生态文明建设具有重大意义。

为加快堆肥的腐熟进程、改善堆肥产品质量，使用微生物添加剂是一种较好的方法，其中人工筛选搭配的微生物腐熟剂已广泛应用于各种原料的堆肥中[3]。然而，研制一套高效的微生物腐熟剂往往需要花费大量的人力和时间，使用商用微生物腐熟剂则需要增加成本。堆料中富含各种微生物，其本身可被看作天然的微生物腐熟剂，并且这种天然的微生物腐熟剂恰好适应相应的堆肥原料，其作用效果可能优于人工分离的微生物添加剂。并且将堆肥过程中的堆料混合于新鲜原料中有利于堆肥的连续化生产，对堆肥产业化发展具有积极正面的影响。目前，将成熟堆肥物料作为添加剂应用于堆肥生产的研究报道较多[4-8]，这些报道主要集中于研究成熟堆料对堆肥腐熟及堆肥过程中温室气体减排的作用效果。而利用高温期堆料作为添加剂的研究鲜有报道，因此有必要进行研究。

本研究将温室内桶装发酵的高温期羊粪堆料添加于在室外(有顶)发酵场进行的羊粪与油菜秸秆混合而成的条垛式堆肥中，通过测定堆肥过程中温度、碳氮比、种子发芽指数等指标以及堆肥过程中多种酶的活性，研究高温期堆料对青藏高原羊粪堆肥发酵品质及酶活性的影响，以期为该地区畜禽粪便堆肥化高效利用和连续化生产提供理论依据和生产工艺。

1 材料与方法

1.1 试验原料

高温期堆料取自温室内桶装发酵第5天的高温羊粪堆料(温度为58 ℃左右)，该堆肥物料是将羊粪和油菜秸秆以4∶1(干重)比例混合发酵而成。供试羊粪为藏系绵羊粪，于2020年7月30日取自青海省巴卡台农牧场同一羊舍(青海省海南藏族自治州共和县巴卡台农牧场，海拔3 300 m左右)，用塑料铲取羊舍表层羊粪并混合均匀，并经过春季自然干燥。油菜秸秆取自于巴卡台农牧场农田，风干后粉碎至1 cm作堆肥调理剂。高温期堆料、供试羊粪和油菜秸秆理化性质见表1。

1.2 堆肥制备及样品采集

堆肥试验于2020年8月1日—2020年8月28日在青海省巴卡台农牧场进行，试验堆体采用长、宽、高为2 m×1 m×0.6 m的条垛式。本次羊粪堆肥试验原料以羊粪和油菜秸秆4∶1比例混合而成，堆体初始含水率为60%。试验共设置2个处理组，分别为添加20%高温堆料的处理组(DL)和不添加高温堆料的对照组(CK)。试验每个处理组设置3个平行，分别于第3、7、10、14、21、28天进行人工翻堆取样(第0和1天不翻堆，取样)，在第3、7、10、14、21天取样后，对堆体进行补水，使其含水率在60%左右。将样品分为2份，一份鲜样于4 ℃保存，另一份风干研磨过1 mm筛后备用。

1.3 指标测定及数据处理

每天上午9：00、下午16：00测量堆体温度，将温度计均匀插入堆体上、中、下层各3个地点，计算9个点的平均温度；使用鼓风干燥机(DHG-9123A型)在105 ℃下烘干样品至恒重，根据烘干前后质量差计算堆肥含水率；总有机碳(TOC)采用重铬酸钾容量法测定[9]；总氮(TN)采用凯氏定氮法测定(KDY-9830型凯氏定氮仪)；铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)含量使用流动分析仪测定(Seal-AA3型连续流动分析仪)；将新鲜堆肥样品用去离子水以固液比为1∶10浸提3 h后过滤，分别用pH计(瑞士梅特勒-托利多S20型)和电导率仪(雷磁DDB-303A型)测定pH和电导率(EC)；将堆肥浸提液分别在465和665 nm波长下测定吸光度值(Gold S54T型紫外-可见分光光度计)，两吸光度的比值为E4/E6[10]；取堆肥浸提液20 mL于9 cm的培养皿中，并垫上滤纸，向浸提液中添加20颗小白菜种子，于20 ℃的黑暗条件下培养48 h后测定种子发芽率和根长，参考Arias等[11]公式计算种子发芽指数(GI)：

堆肥有机质含量采用550 ℃灼烧法测定；木质纤维素的测定采用范式洗涤法[12-13](ANKOM 2000i全自动分析仪)；有机质、半纤维素、纤维素和木质素降解率参考Liu等[14]和Kulikowska等[15]公式计算：

其中，X1为原料灰分含量(%)；X2为样品灰分含量；OL2分别为样品中有机质、半纤维素、纤维素、木质素含量；OL1为原料中有机质、半纤维素、纤维素、木质素含量。

堆肥蛋白酶活性测定采用茚三酮比色法测定；酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；糖酶和纤维素酶活性均采用3，5-二硝基水杨酸法测定；葡萄糖苷酶活性采用硝基酚比色法测定；过氧化物酶和多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法测定。

1.4 数据统计分析

利用SPSS 23.0软件进行数据处理，数据以平均值±标准差表示，并对每个取样点的试验数据进行独立样本t检验，利用Origin 2021b软件进行作图。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 堆肥过程中温度、含水率、pH及EC的变化

由图1A可知，两个处理组堆肥初始温度均为13 ℃，随后堆体温度迅速上升，DL和CK组在第1天的堆体温度分别上升至54.4和42 ℃。两组堆体温度均在第2天达最高值，分别为62.6和57.5℃。DL组在堆肥前10 d的堆体温度均超过50 ℃，而CK组堆体温度超过50 ℃的天数仅为4 d。堆肥15 d后，两组堆体的温度均低于30 ℃，并持续下降至20 ℃以下。

由图1B可知，两个处理组堆体含水率呈现波动趋势。堆肥第3和7天，DL和CK组堆体含水率分别下降至51.5%、53.3%和47.6%、50.9%，随后通过补水，两个处理组堆体含水率恢复到60%。堆肥结束时，DL和CK组堆体含水率分别为48.3%和46.4%。

由图1C可知，堆肥初期，两组样品pH均上升，堆肥第3～10天，两组堆体的pH均呈下降趋势。堆肥第10天至堆肥结束，两组堆肥pH逐渐上升并趋于稳定。由图1D所示，堆肥初期，两组样品EC值均快速上升，其中DL组于第3天上升至最大值(2.52 mS/cm)，CK组于第5天上升至最大值(2.49 mS/cm)。随后，两组样品EC值均下降，并于堆肥后期逐渐稳定。

同一时间不同组间比较，肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 堆肥过程碳氮及腐熟指标的变化

由图2A可知，两个处理组堆体的TOC含量在整个堆肥过程中持续下降。堆肥结束时，DL和CK组的TOC含量分别为34.9%和37.4%，差异显著(P<0.05)。两个处理组样品在整个堆肥过程的TN含量均呈上升趋势(图2B)，堆肥结束时，DL和CK组的TN含量分别为2.82%和2.59%，差异显著(P<0.05)。由图2C可知，在堆肥前期，两处理的C/N迅速降低，14天后，所有处理的C/N下降缓慢并逐渐趋于稳定。堆肥结束时，DL和CK组C/N分别为12.4和14.4，差异显著(P<0.05)。

由图2D可知，两个处理组堆体的NH4+-N含量变化趋势均是先增加后减少；DL和CK组的NH4+-N含量均在第10天达到最高值，分别为4 132和3 743 mg/kg，差异显著(P<0.05)；堆肥结束时，DL和CK组的NH4+-N含量分别为1 013和1 423 mg/kg，差异显著(P<0.05)。由图2E可知，两个处理组NO3--N含量在堆肥前14 d均增加较少，而在堆肥第14～28天迅速增加，堆肥结束时，DL和CK组的NO3--N含量分别为2 943和2 623 mg/kg，差异显著(P<0.05)。由图2F可知，两个处理组NH4+-N/NO3--N值在整个堆肥过程均呈现下降趋势，堆肥结束时，DL和CK组的NH4+-N/NO3--N分别为0.34和0.54，差异显著(P<0.05)。

由图2G可知，两组堆肥GI值在前期均呈下降趋势，并于第3天达到最低值，均低于45%。随后，均迅速增加，堆肥结束时，DL组的GI值为103.1%，比CK组(90.4%)提高了14%，差异显著(P<0.05)。由图2H可知，DL组在堆肥5～21 d的E4/E6值维持在2.6左右，随后快速上升，于堆肥结束时达到2.82；而CK组E4/E6值于21 d时为2.89，堆肥结束时达到3.07，说明添加高温堆料可显著降低堆肥产品E4/E6值(P<0.05)。

图2 堆肥过程碳氮及腐熟指标的变化

2.3 堆肥过程中有机成分及其降解率的变化

堆肥过程有机质含量及其降解率见图3A和3B，两个处理组堆体有机质含量均在堆肥前10 d迅速下降。堆肥第10天，DL和CK组有机质降解率分别为39.9%和31.6%，差异显著(P<0.05)。随后两组样品有机质降解速度均减慢并最终趋于稳定，堆肥结束时，DL和CK组有机质降解率分别为45.9%和39.3%，差异显著(P<0.05)。

半纤维素、纤维素和木质素的含量和降解率的变化见图3C～3H，在整个堆肥过程中，两个处理组堆肥中半纤维素和纤维素的含量均呈下降趋势，而木质素含量呈上升趋势。堆肥前期，两组堆肥半纤维素、纤维素和木质素均快速降解。在堆肥10 d后，DL和CK组堆肥中半纤维素、纤维素和木质素的降解率分别达35.4%和26.8%、46.2%和36.4%、13.3%和10.8%。随后半纤维素-纤维素和木质素的降解速度均逐渐减慢，堆肥结束时，DL和CK组的半纤维素、纤维素和木质素降解率分别为40.6%和35.0%、58.7%和50.7%、15.9%和14.8%，均呈现出显著差异(P<0.05)。

图3 堆肥过程中有机成分及其降解率的变化

2.4 堆肥过程中酶活性的变化

两个处理组堆肥过程中酶活性的变化见图4，两个处理组蛋白酶活性在堆肥第1天达到整个过程的最高值，随后两个处理组堆肥蛋白酶活性下降并维持稳定(图4A)。两个处理组脲酶活性在堆肥初期较低，随后逐渐升高，于堆肥第14天达到最高，在第21天再次降低。DL组脲酶活性除在堆肥第1和28天低于CK组外，其余阶段均显著高于CK组(P<0.05)(图4B)。两个处理组堆肥第1天蔗糖酶活性高于第0天，随后在堆肥前期逐渐降低，并于后期逐渐升高(图4C)。两个处理组堆肥纤维素酶在1～3 d活性较高，随后活性降低并逐渐稳定(图4D)。整个堆肥过程，DL组纤维素酶活性均显著高于CK组(P<0.05)。两组β-葡萄糖苷酶在堆肥第1～5天活性均较高，并且逐渐上升，随后活性降低并逐渐稳定，DL组β-葡萄糖苷酶活性在堆肥前14 d显著高于CK组(P<0.05)，在后期低于CK组(图4E)。两个处理组过氧化物酶活性均先缓慢增加，并在堆肥第14天达到最高，随后逐渐降低，DL组过氧化物酶活性在堆肥整个过程均显著高于CK组(P<0.05)(图4F)。两个处理组多酚氧化酶活性在堆肥初期较低，随后活性逐渐升高，DL组在堆肥发酵前21 d均显著高于CK组(P<0.05)，在堆肥第28天与CK组差异不显著(P>0.05)(图4G)。

图4 堆肥过程中酶活性的变化

3 讨 论

3.1 堆肥过程中温度、含水率、pH及EC的变化

温度是反映堆肥中有机物降解和微生物活性的最关键指标之一。堆肥过程中的高温可以杀死沙门氏菌、大肠杆菌和蛔虫卵等病原微生物，是实现堆肥无害化的重要保障。堆肥初期，由于堆体中大量易降解有机物质的降解，导致两个处理组堆体温度迅速上升，并很快进入堆肥高温期(>50 ℃)。DL组升温速度、最高温以及高温期均优于CK组。这表明在堆肥前期，添加高温期堆料有利于堆肥升温，提高堆体最高温度并延长高温期。这与高温堆料中富含Bacillus、Planifilum、Thermobifida和Thermobacillus等耐高温且具有木质纤维素等有机质降解能力的微生物有关[16-18]。DL组持续的高温期符合畜禽粪便无害化卫生要求[19]，而CK组不符合。

两个处理组在堆肥前期的含水率均快速下降，这与前期堆体温度较高和青藏高原干燥的气候密切相关。随着堆体温度下降，两个处理组堆肥含水率下降速率减缓。DL组含水率在发酵前期的下降速率快于CK组，这主要是DL组发酵升温速度快，堆体温度更高，导致其水分蒸发速率快于CK组。通过定期的补水，可保证两个处理组堆肥正常发酵，并最终腐熟。

堆肥初期，两个处理组样品pH均上升，这可能与堆肥初期有机氮在氨化作用下产生大量的NH4+-N有关[4]。随后，由于大量低分子有机酸和CO2的产生，两个处理组堆肥pH均呈下降趋势[20]。堆肥后期pH逐渐上升，这是由小分子有机酸的降解和氨气的释放导致的[4]。

EC值可反映堆肥浸提液的离子总浓度大小，即可溶性盐的含量，其主要由有机酸盐类和无机盐组成,而堆肥中该成分对作物具有毒害作用[21]。一般认为，农用堆肥的EC值不超过3.5 mS/cm时，其对作物的危害作用较小[22]。堆肥前期EC值的上升主要是由于微生物降解有机质产生了大量无机盐和小分子有机酸，堆肥中后期，氨气挥发、各种盐离子沉淀以及小分子有机酸的降解导致堆体的EC值下降[23]。堆肥结束时，两个处理组样品的EC值均低于3.5 mS/cm，且添加高温期堆料可降低堆肥产品EC值。

3.2 堆肥过程碳氮及腐熟指标的变化

两个处理组TOC含量变化与有机质含量变化类似，这是由于含碳有机物是羊粪堆肥有机质的主要组成部分。两组样品在整个堆肥过程的TN含量均呈上升趋势，这是因为堆肥中含碳有机物质的持续快速降解，由于“浓缩效应”造成TN含量相对升高[24]，这种效应掩盖了堆肥过程中含氮气体(NH3和NOX等)的释放造成的氮素损失。堆肥结束时，DL组TN含量高于CK组，表明添加高温期堆料可提高羊粪堆肥产品的TN含量。C/N是堆肥过程中的关键指标，可以用来作为评估堆肥成熟度的指标[25]。堆肥前期C/N迅速下降，这个结果可归因于有机碳的降解速度快于有机氮[4]。堆肥结束时，DL组TN含量高于CK组，这表明添加高温期堆料可显著降低堆肥产品C/N，促进堆肥腐熟。

NH4+-N和NO3--N是堆肥氮素的重要组成部分。堆肥初期，堆体中含氮有机质大量降解，导致NH4+-N含量迅速增加[26]。随着堆肥进行，堆体中微生物的同化作用、硝化作用以及NH3的大量挥发，导致堆体中NH4+-N含量逐渐减少[27]。堆肥初期，堆体温度较高，抑制了硝化菌的活性，导致NO3--N含量较低。而在堆肥中后期，由于堆体温度下降，促进了堆体的硝化作用，使得大量NH4+-N转化为NO3--N，并使NO3--N含量迅速上升[28]。硝化作用有利于堆肥的保氮，可使堆肥含有更多可利用的氮素[29]。添加复合菌剂硝化指数(NI)是指NH4+-N 与NO3--N含量的比值，常用于评估堆肥的成熟度，其值越低，表明堆肥产品腐熟度越高。本研究结果表明，添加高温堆料可促进堆肥中后期NO3--N含量增加和羊粪堆肥腐熟。

GI通常被用来评估堆肥产品的毒性和成熟度，是最重要的堆肥品质指标之一[30]。堆肥初期GI值呈下降趋势，这是由于堆肥初期堆肥有机质快速降解，产生大量的短链脂肪酸、苯酚以及氨气等物质，这些物质对植物种子具有严重的毒害作用[31]，相同的结果也出现在之前的一些研究中[32-33]。随着有毒物质的快速降解，两个处理组堆肥GI值均迅速增加。根据之前的研究表明，堆肥GI值>80%即可表明堆肥完全成熟[12,34]，依据这个标准，本试验的两个处理组堆肥最终均达到腐熟标准，且添加高温期堆料可提升堆肥的成熟度。E4/E6是评价堆肥腐熟度的腐殖化参数之一，其值越小，表明堆肥腐殖化程度越大。本研究结果表明，添加高温期堆料可促进堆肥腐殖化程度。综合上述腐熟指标的变化表明，添加高温期堆料可显著缩短青藏高原羊粪堆肥腐熟时间，减少堆肥生产周期，进而增加单位时间内的羊粪堆肥生产量，这对该地区羊粪废弃物的减量化和资源化利用具有极其重要的意义。

3.3 堆肥过程有机成分及其降解率的变化

两个处理组堆肥有机质在堆肥前期均快速降解，这部分有机质主要为易降解的糖类、蛋白质等有机质。随着易降解有机质快速降解，堆体中有机质主要由稳定的腐殖类物质组成，堆肥物料降解受到限制。高温堆料中富含木质纤维素等有机质降解菌株，可促进堆肥有机质降解。木质素通常与纤维素、半纤维素相互连接形成具有抗生物降解能力的复杂化合物，被认为是堆肥过程中降解最困难的部分。本次堆肥试验中，木质素降解率低于半纤维素和纤维素，并且其相对含量在堆肥过程中持续上升，这与之前的一些研究报道相似[14,35]。在本次试验中，CK组木质素含量及其降解率在整个堆肥过程中均低于DL组，表明添加高温期堆料可促进木质纤维素的降解，这与高温期堆料中富含木质纤维素降解菌密切相关。

3.4 堆肥过程中酶活性的变化

堆肥原料富含易利用的糖类、蛋白质、脂肪以及难降解的木质纤维素等有机物质，生物可降解性较强。堆肥中微生物分泌的胞外酶是促进堆肥无害化、减量化及资源化必不可少的活性物质，不仅能催化降解堆肥物料中各种有机质，还在腐殖质的合成以及污染物毒性的削减等过程中发挥着极其重要的作用，有效控制酶作用对实现有机废弃物资源化利用具有重要意义[36]。蛋白酶在堆肥第1天活性最高，这催化着堆体中蛋白质在堆肥初期快速降解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。脲酶活性与物料的微生物数量、全氮和速效磷含量等密切相关[37]。蔗糖酶(转化酶)可特异性催化非还原糖中β-D-呋喃果糖苷键的水解，可催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，为微生物代谢提供直接能量[38]。堆肥中过氧化物酶能氧化堆体中有机质，是堆肥微生物生命活动的结果，在腐殖质的形成过程中起着重要的作用。多酚氧化酶对堆肥中芳香族化合物的转化起着重要的作用，可催化酚类物质氧化成醌，其活性的变化反映堆肥腐殖化程度与速度，可在一定程度了解堆肥的腐殖化进程[39]。整体而言，添加高温期堆肥可以提高堆肥中多种酶活性，特别是在堆肥的快速发酵阶段。添加高温期堆料可通过提高堆肥中关键酶活性，促进堆肥中木质纤维素等有机物质的降解，进而促进堆肥腐熟，缩减堆肥发酵时间。

4 结 论

添加高温期堆料可促进堆体升温，延长堆体高温期，提升堆肥GI值，并可缩短堆肥腐熟所需时间。添加高温期堆料可促进堆肥有机物质和木质纤维素降解，并可提升堆肥过程中蛋白质酶、脲酶、蔗糖酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化物酶及多酚氧化酶活性。