1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

杨泽敏，李 双，金正雨，廖义潇，杨 颖，3，文 明，3

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳 550025；3.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵阳 550025)

近年来，中国水产养殖集约化发展，许多水产养殖中的疾病仍无有效防治疫苗，加上抗生素滥用，导致水产养殖环境日益恶化[1-3]。随着中国全面禁止抗生素类添加剂在饲料中使用，益生菌作为抗生素的替代品备受关注，并越来越多地应用于水产养殖业中[4-6]。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是指一类能发酵糖类产生有机酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，是应用最早的一种益生菌，具有颉颃有害细菌、提高免疫力及提供营养物质等作用，已被应用添加于多种动物饲料中[7-8]。已有学者初步揭示了乳酸菌对促鲤鱼生长、增强免疫、维持肠道菌群平衡、抑制病原菌及改善水体环境等作用。李利等[9]发现，在鲤鱼饲粮中添加乳酸菌促进了鲤鱼的生长及提高了肠道酶活性。桂远明等[10]从鲤鱼肠道内分离干酪乳杆菌制成生物制品对鲤鱼进行饲喂，促进了鲤鱼生长，提高了鲤鱼免疫水平及抗病能力。何宇智[11]发现乳酸菌能有效调控水体中氨氮、亚硝酸盐氮的含量，对改良水质有较好的效果。

已证实益生菌制剂在水产养殖中具有多种益生功能，但在鲤鱼上的应用研究相对较少。因此，本研究拟从鲤鱼肠道内分离鲤源乳酸菌，并对分离菌进行生物学特性分析，以期筛选到优质鲤源乳酸菌，为后续制备鲤鱼用益生菌制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及细菌 健康鲤鱼购自贵州省贵阳市花溪区市场；嗜水气单胞菌、维气氏单胞菌均由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供；柱状黄杆菌由中国水产科学研究院珠江水产研究所惠赠。体重18～20 g的健康昆明小鼠购自贵州医科大学。

1.1.2 主要试剂 Shieh培养基(江苏绿叶生物有限公司)；MRS培养基、LB培养基、HIB培养基、革兰氏染色试剂、通用基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；PCR反应试剂(天根生化科技(北京)有限公司)；药敏试纸(温州康泰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 将鲤鱼处死后，进行体表消毒，在超净工作台中剖开鲤鱼腹腔，取出前肠和中肠，纵向剪开肠道，用载玻片刮取肠道内容物及肠道黏膜置于培养皿中，与5 mL PBS充分混合，取2 mL混合液加入盛有200 mL MRS三角锥形瓶中，置于37 ℃培养箱24 h进行富集培养。取1 mL富集液加入9 mL PBS中混匀，随后进行倍比稀释,取稀释度为10-6、10-7、10-8、10-9和10-10的富集液进行涂板，挑取菌落形态不一的单个菌落在MRS平板纯化4代，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 分离菌16S rRNA鉴定 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述分离纯化后细菌的DNA，并以此作为模板采用通用引物进行PCR扩增。扩增引物为：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系25 μL:2×TaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，利用MegAlign软件构建系统发育树。

1.2.3 分离菌生长特性及产酸能力测定 取100 μL分离菌培养液接种于200 mL MRS培养基中，37 ℃恒温培养。每隔4 h取样，以空白培养基为对照，测定600 nm波长下的吸光度(D600 nm值)，同时测定菌液的pH，以菌液培养时间为横坐标、D600 nm值和pH为纵坐标分别绘制生长曲线和产酸曲线。

1.2.4 分离菌耐受试验 用盐酸配制pH为3.0、2.5和2.0的PBS，用牛胆盐配制浓度为0.3%、0.2%和0.1%的胆盐，分别取100 μL分离菌培养液接种于10 mL上述配制好的溶液中，以未处理的PBS作为对照，置于37 ℃培养箱1 h后，取菌液涂布平板计数，每组设置3个重复。

1.2.5 分离菌抑菌试验 采用牛津杯法测定分离菌对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、柱状黄杆菌的抑制情况。嗜水气单胞菌和维气氏单胞菌置于29 ℃恒温培养24 h，柱状黄杆菌置于29 ℃ 恒温培养48 h，各取100 μL分别均匀涂布于LB、BHI和shieh琼脂培养基上；待平板稍干，放上牛津杯，待测菌液培养24 h后 8 000×g离心5 min，取200 μL上清液加入牛津杯内，同时加入等量MRS空白培养基作对照，置于29 ℃培养箱中恒温培养，测量并记录抑菌圈直径大小。

1.2.6 分离菌药物敏感性试验 采用K-B法测定分离菌株的药物敏感性，使用0.5麦氏标准比浊管对菌株培养液进行标定并校正，取100 μL涂布于MRS琼脂培养基上，用无菌镊子将药敏片放置于培养基表面，37 ℃培养24 h，测量并记录抑菌圈直径大小，依据药敏纸片判定标准判定细菌的药物敏感性[12]。

1.2.7 小鼠安全性试验 取体重18～20 g的昆明种健康小鼠12只，分成2组，每组6只，雌雄各半。对照组灌胃PBS，试验组灌胃1 mL浓度为1×108CFU/mL的分离菌株，每天一次连续1周，观察记录小鼠的生长情况。

2 结 果

2.1 细菌分离与纯化结果

经分离纯化后得到的分离菌在MRS固体培养基上的菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色(图1A)；革兰氏染色为阳性、两端钝圆的短小杆菌，无芽孢(图1B)；将该菌株命名为YY001。

图1 分离菌菌落形态(A)和革兰氏染色镜检图(B，1 000×)

2.2 16S rRNA鉴定

以YY001株的基因组为模板，通用引物PCR扩增出大小约1 500 bp的条带(图2)，与预期大小相符。测序结果显示该扩增片段大小为1 457 bp，经BLAST对比后，利用MegAlign软件构建系统发育树，YY001株与8株植物乳杆菌聚为一簇，且与植物乳杆菌(登录号：MT463427.1)亲缘性关系最近，置信度达100%(图3)。综合分离菌的形态学特征及基因序列分析结果，判定该株分离菌为植物乳杆菌。

图2 YY001株16S rRNA 基因PCR扩增结果

图3 基于16S rRNA基因的系统发育树

2.3 生长特性及产酸能力测定

由图4可知，YY001株在培养4 h后进入对数生长期，培养12 h 后进入稳定期，培养20 h后进入衰亡期。由图5可知，随着细菌的不断增殖，产酸不断积累，0～12 h pH迅速下降，12～16 h pH下降缓慢，16 h后趋于稳定，最终pH稳定在3.8。

图4 YY001株的生长曲线

图5 YY001株的产酸曲线

2.4 耐受试验

YY001株分别经 pH 3.0、2.5和2.0 PBS,0.3%、0.2%和0.1%胆盐，以及常规PBS(pH 7.0)处理后，活菌数分别为9.1×108、2.1×107、1.9×107、1.78×107、3.0×105、2.37×106和2.52×106CFU/mL，菌株在不同pH和不同胆盐浓度下均具有一定的存活率(图6)，说明菌株对酸、胆盐环境均具有一定的耐受能力。

图6 YY001株耐受试验结果

2.5 抑菌试验

由图7可知，YY001株对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和柱状黄杆菌均有一定的抑制作用。其中，对柱状黄杆菌的抑制效果最好，抑菌圈直径为34.19 mm；对嗜水气单胞菌的抑制效果次之，抑菌圈直径为14.56 mm；对维气氏单胞菌的抑制作用效果最弱，抑菌圈直径为11.77 mm。

①A，维气氏单胞菌；B，嗜水气单胞菌；C，柱状黄杆菌。②空白，MRS肉汤对照

2.6 药物敏感性试验

由表1可知，YY001株对四环素、红霉素、克林霉素和氯霉素表现为敏感；对庆大霉素表现为中度敏感；对卡那霉素、链霉素和万古霉素表现为耐药。

表1 YY001的药物敏感性试验结果

2.7 小鼠安全性试验

连续灌胃分离菌YY001 1周后，试验组与对照组小鼠均呈现生长状况健康良好，无发病和死亡。说明108CFU YY001株对小鼠无毒害作用。

3 讨 论

近年来，益生菌在水产养殖中的研究取得了很大进展[13]。已有大量研究证实，益生菌在凡纳滨对虾、泥鳅、中华鳖、草鱼、斜带石斑鱼、刺身[14-17]等水产养殖业中应用都有较好的效果。但目前水产养殖用益生菌大多来自非水生生物，有研究报道宿主源性益生菌具有更好的定植能力，从而促进更优的益生特性[18]；曾东[19]已证实从鲤肠道及养殖水体中分离到的益生菌相较其他从陆生动物中分离的益生菌，在鲤鱼肠道中具有更好的适应性和应用性。所以本研究从鲤鱼肠道内容物及黏膜中分离鲤鱼源性益生菌菌株，以期应用于鲤鱼微生态制剂的研制。

本研究分离到的植物乳杆菌在耐酸及胆盐试验中，在不同pH条件下具有较好的耐受力，在不同浓度的胆盐条件下均具有耐受力，在0.3%胆盐浓度下与对照组相比存活率相对较差。菌株耐胆盐能力较差的情况可能是因为鲤鱼属于无胃鱼类，肠道pH约为中性环境且无胆盐[20]，所以对胆盐的耐受力不强。

植物乳杆菌可通过代谢产生有机酸包括乳酸、丙酸、丁酸和细菌素等有益物质，从而抑制肠道有害微生物生长[21-22]。张洪玉[23]用植物乳杆菌饲喂斑点叉尾鮰，结果显示，试验组肠道内致病菌的比例显著降低，可减少斑点叉尾鮰肠道疾病暴发的风险。本试验中分离到的植物乳杆菌对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均抑菌作用，且该菌株对柱状黄杆菌的抑菌效果显著，说明分离到的植物乳杆菌可作为鲤鱼微生态制剂候选菌株，有望降低鲤鱼肠道疾病的发生。

近年来，耐药菌不断出现，其携带耐药基因的传播日益受到人们的关注，长期以来细菌耐药性和耐药基因研究主要集中在病原菌上，而对益生菌的耐药性研究相对较少[24]。随着益生菌的不断开发利用，益生菌的耐药性被作为益生菌安全性评价指标之一。本研究药物敏感性试验结果显示，分离菌株对四环素、红霉素、克林霉素和氯霉素表现为敏感，对庆大霉素表现为中度敏感，表明分离株对多数水产常用抗生素敏感；对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药，这可能与生长环境不同及抗生素滥用导致耐药性等因素有关，本试验分离菌株的耐药基因是否会传递还需进一步试验进行评估。

4 结 论

本研究从健康鲤鱼肠道中分离到1 株乳酸菌，通过16S rRNA 基因测序比对，确定该菌株为植物乳酸杆菌，将其命名为YY001。该分离株具有较好的耐酸耐胆盐性能、产酸能力强和能有效抑制水产常见致病菌等优良生物学特性，有望作为水产养殖微生态制剂的益生菌种。