火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝损伤的机制研究

沈幸玲，丁康宁，王幽丛，张易安，刘逸雷，刘涵笑，唐陆平，何永明

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山 528225)

鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium)是一种食源性病原体，可经消化道、呼吸道等途径传播[1]，主要侵害人和动物的肠道。其通过复杂的途径入侵宿主并进行复制[2]，易导致一系列病症，包括胃肠炎、菌血症和局部感染，也会引起肝损伤，主要表现为炎症细胞浸润、严重充血、肝细胞凋亡和肝脏氧化损伤、变性和坏死等[3-4]。沙门菌的血清型众多且菌株复杂，因环境不同而产生差异菌株，防控极其困难[5]。中国中兽药资源丰富，应用历史悠久，且毒副作用小、安全有效，在细菌和病毒感染疾病防治方面取得了显著成绩[6]。火炭母(PolygonumchinenseL.,PCL)是一种蓼科植物，主要分布于中国的西南地区，含有多种多酚，如槲皮素、没食子酸、表儿茶素、绿原酸等，具有良好的抗氧化、抗菌、消炎、止泻作用，常用于治疗腹泻、肠炎、痢疾和肝炎等疾病[7]。鉴于火炭母具有良好的抗菌消炎功效，且对小鼠肝损伤具有一定的保护作用，本研究拟建立鼠伤寒沙门菌感染小鼠模型，探讨火炭母对其肝脏的保护作用及可能的机制，以期开发一款中药制剂，用于预防或治疗鼠伤寒沙门菌所致的肝损伤。

1 材料与方法

1.1 菌株及试验动物

鼠伤寒沙门菌菌株(编号：14028，半数致死量(LD50)为5×104CFU/mL)由广东省微生物菌种保藏中心提供。48只3～5周龄，体重14～16 g的雄性健康SPF级BALB/c小鼠，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：44007200083689。所有动物饲养于佛山科学技术学院动物室，室内温度控制在(23±2)℃，12 h光/暗循环。提供啮齿动物标准饮食，小鼠自由饮水、饮食。所有动物工作均按照中华人民共和国科学技术部制定的《实验动物护理和使用指南》(批准文号：2006—398)进行，并经佛山科学技术学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

火炭母(批号：190501,北京同仁堂中药有限公司)；庆大霉素(Sigma公司)；亮绿琼脂培养基(Solarbio公司)；α干扰素(IFN-α)抗体、IFN-β抗体、IFN-γ抗体、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体、白介素1β(IL-1β)抗体、TANK结合激酶1(TBK1)抗体、磷酸化TANK结合激酶1(P-TBK1)抗体、干扰素调节因子3(IRF3)抗体、磷酸化干扰素调节因子3(P-IRF3)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(Cell Signaling Technology公司)；ECL(增强型化学发光试剂)发光底液(Bio-Rad公司)。

1.3 火炭母口服液制备与主要成分测定

火炭母药材以药液比1∶20加入超纯水，浸泡0.5 h，煎煮1 h，收集药液，共煎煮3次，合并药液，纱布过滤，蒸发浓缩至分别含生药0.8、0.4和0.2 g/mL的火炭母口服液，置于4 ℃密封保存。

利用高效液相色谱法(HPLC)检测火炭母主要化学成分。主要材料为Ecosil C18 5 μm,4.6×250 mm色谱柱，使用梯度程序：A液为0.1%磷酸水溶液，B液为乙腈；50 min内从15% A液到30% A液的线性梯度，15% A液持续25 min，以0.5 mL/min的流速洗脱火炭母中的化合物，在260 nm处检测，柱温控制在40 ℃，进样量20 μL。检测前色谱柱先用流动相平衡10～30 min，所有检测样品进样前均先经0.22 μm滤膜过滤。

1.4 试验动物饲养与给药

将48只试验小鼠随机分为6组：空白对照组(NC)、模型组(MOD)、阳性药物组(PC,鼠伤寒沙门菌+20 mg/kg庆大霉素(GM))、火炭母高剂量组(PCL-H,鼠伤寒沙门菌+16 g/kg火炭母)、火炭母中剂量组(PCL-M,鼠伤寒沙门菌+8 g/kg火炭母)和火炭母低剂量组(PCL-L,鼠伤寒沙门菌+4 g/kg火炭母)，每组8只。给药体积为2 mL/100 g，阳性药物组灌胃给予庆大霉素溶液，火炭母高、中、低剂量组分别灌胃给予0.8、0.4和0.2 g/mL火炭母口服液，模型组和空白对照组小鼠灌胃等体积的PBS，预防性给药2 d后，除空白对照组外，其他组小鼠一次性灌胃0.2 mL 5×104CFU/mL鼠伤寒沙门菌诱导感染，空白对照组灌胃等体积PBS，继续给药6 d，采用乙醚麻醉再颈椎脱臼处死所有小鼠，解剖取肝脏组织备用。

1.5 肝脏组织病理检查

取各组小鼠肝脏的相同部位，在4%多聚甲醛中固定24 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，进行切片，厚度3～5 μm，展片、脱蜡后，采用HE染色，梯度酒精脱水，中性树胶封片，光学显微镜下镜检，观察小鼠肝脏组织病理学特征及变化。

1.6 鼠伤寒沙门菌细菌负荷测定

称取约0.02 g肝脏组织于1 mL预冷的PBS中，经组织破碎仪破碎，进行10倍梯度稀释，吸取各浓度匀浆液100 μL至亮绿琼脂无菌培养板中，每个梯度3个重复，置于37 ℃培养箱中培养24 h，记录培养基表面的单个菌落数，计算载菌量。

1.7 Western blotting分析小鼠肝脏蛋白表达量

将细胞组织快速裂解液(RIPA Lysis Buffer)与苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制剂(PMSF)100∶1混合，用于提取小鼠肝脏的总蛋白；经SDS-PAGE分离，低温下湿法转膜至PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；TBST清洗PVDF膜；将PVDF膜分别与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IRF3、P-IRF3、TBK1、P-TBK1一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST清洗3次，每次10 min；用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；ECL发光底液进行显色，通过 Image J软件分析蛋白质的相对强度。

1.8 统计分析

试验数据使用 SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，试验结果均以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 火炭母口服液主要成分及其含量测定结果

火炭母的HPLC指纹图见图1。没食子酸(峰1)、绿原酸(峰2)和金丝桃苷(峰3)是火炭母的主要化学成分，试验中火炭母口服液的3种指示成分质量控制如下：没食子酸≥0.9 mg/g，绿原酸≥2.5 mg/g，金丝桃苷≥4.7 mg/g。

峰1，没食子酸；峰2，绿原酸；峰3，金丝桃苷

2.2 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏病理变化的影响

空白对照组小鼠肝脏中肝小叶结构完整；肝细胞以中央静脉为中心放射状排列，胞质染色不均匀，HE染色可见大量空泡，细胞核被染成蓝色，呈不等数量分叶，细胞膜染成红色，细胞边界清晰；窦状隙中存在少量炎症细胞(图2A)。模型组小鼠肝脏中央静脉边界不清，血管通透性增加，大量炎性细胞进入血管(以淋巴细胞和中性粒细胞为主)，肝脏组织有红细胞渗出；肝细胞排列紊乱，明显肿胀，结构发生变化，胞质染色加深，空泡减少，可见肝细胞坏死和凋亡，边界不清晰；肝窦炎性细胞增多(图2B)。阳性药物组小鼠肝脏组织中炎症反应明显减少，少量红细胞渗出，肝细胞坏死的情况明显减轻，肝细胞轻度肿胀，排列紊乱(图2C)。火炭母高剂量组小鼠肝脏组织中肝细胞肿胀、排列紊乱、胞质染色深，部分肝细胞坏死，炎症细胞浸润，轻微淤血(图2D)；火炭母中剂量组小鼠肝细胞轻微肿胀、排列紊乱，少量炎症细胞浸润、红细胞渗出、肝细胞及凋亡的情况得到极大的改善(图2E)；火炭母低剂量组小鼠肝细胞轻微肿胀、排列紊乱、胞质染色深，少量炎症细胞浸润，未见明显的淤血和肝细胞坏死(图2F)。火炭母中、低剂量组的恢复程度较高剂量组好，与阳性药物组差别不大。

①A，空白对照组；B，模型组；C，阳性药物组；D，火炭母高剂量组；E，火炭母中剂量组；F，火炭母低剂量组。②a，肝细胞肿胀；b，炎症细胞浸润；c，血细胞渗出；d，肝细胞坏死和凋亡

2.3 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏载菌量的影响

由图3可知，相对于空白对照组，模型组小鼠肝脏中鼠伤寒沙门菌负荷显著增加(P<0.05)。与模型组小鼠相比，阳性药物组和火炭母各剂量组小鼠肝脏中鼠伤寒沙门菌生长明显受到抑制(P<0.05)；其中阳性药物组和火炭母中、低剂量组小鼠肝脏中未能检测到鼠伤寒沙门菌的菌落，而火炭母高剂量组仍有鼠伤寒沙门菌附着，但比模型组小鼠肝脏的载菌量显著减少(P<0.05)。

肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.4 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏IRF3及TBK1表达的影响

由图4可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中IRF3蛋白及其磷酸化蛋白P-IRF3的表达显著降低(P<0.05)。与模型组小鼠相比，阳性药物组和火炭母各剂量组小鼠IRF3蛋白表达均显著上升(P<0.05)；阳性药物组和火炭母高、中剂量组小鼠肝脏中P-IRF3表达水平均显著上升(P<0.05)，火炭母低剂量组P-IRF3表达水平显著低于模型组(P<0.05)。

图4 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏IRF3和TBK1蛋白表达的影响

模型组小鼠肝脏中TBK1和P-TBK1蛋白表达水平显著高于空白对照组(P<0.05)。与模型组对比，阳性药物组的TBK1和P-TBK1蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)；而火炭母各剂量组小鼠肝脏中TBK1的表达量显著降低(P<0.05)，P-TBK1表达量则显著上升(P<0.05)。

2.5 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中干扰素表达水平的影响

由图5可知，与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠肝脏中IFN-α、IFN-β和IFN-γ水平均显著下降(P<0.05)。与模型组小鼠相比，阳性药物组及火炭母高、中剂量组小鼠肝脏中IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达水平均显著上升(P<0.05)；火炭母低剂量组则较模型组显著下降(P<0.05)。

图5 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏干扰素表达的影响

2.6 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β蛋白表达的影响

由图6可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β蛋白水平均显著升高(P<0.05)。与模型组相比，阳性药物组小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；火炭母各剂量组小鼠肝脏中TNF-α表达量均显著降低(P<0.05)；火炭母中、低剂量组小鼠IL-1β水平表达显著降低(P<0.05)，而火炭母高剂量组中IL-1β表达量显著升高(P<0.05)。

图6 火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β表达的影响

3 讨 论

中药化学成分是保肝药物的研究热点之一[8]，多糖、苷类、黄酮、生物碱等可对肝脏进行有效保护[9-10]。中药在抗微生物感染领域的研究较多，如中药黄连、大黄、柴胡等对金黄色葡萄球菌有较好的消除作用[11]；而以金银花、连翘和黄芩配伍的双黄连可溶性粉的黄酮组分可发挥抑菌作用[12]。若能合理使用中药，减少抗生素的使用频率，将有助于减少耐药菌的产生。火炭母有酚酸类、甾体类、黄酮类、挥发油等化学成分，可发挥抗炎止痛、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腹泻等药理作用[13]。本实验室首次对广东产火炭母的主要化学成分没食子酸、绿原酸(酚酸类)和金丝桃苷(黄酮醇苷类)同时进行含量测定，以保证药材品质。研究发现，没食子酸具有护肝、抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、止血、保护心血管等多种生物活性[14-15]；绿原酸对多种细菌表现出明显的抗菌活性[16]，且对肝脏疾病也有治疗作用[17-18]；金丝桃苷对酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝疾病都有一定的疗效[19-20]，火炭母或许可通过这些化学成分抗微生物感染，对肝脏起保护作用。

肝脏具有一定的免疫功能，在炎症的发生、维持和消退方面具有重要作用[21]。本研究发现，鼠伤寒沙门菌感染后小鼠肝脏出现明显病变，表现为肝脏组织淤血，炎症明显，肝细胞染色加深、明显肿胀、排列紊乱，可见区域性的肝细胞坏死和凋亡。从肝脏病理切片的结果来看，火炭母的抗炎效果虽不及庆大霉素，但仍能有效改善鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中的炎症反应，且能减少肝脏组织淤血、肝细胞坏死及凋亡。载菌量结果显示，模型组小鼠肝脏中鼠伤寒沙门菌负荷极高，空白对照组、阳性药物组、火炭母中、低剂量组均未检测出菌落生长，火炭母高剂量组有少量鼠伤寒沙门菌。以上结果提示，火炭母口服液对鼠伤寒沙门菌引起的小鼠肝损伤起到很好的治疗效果，其作用效果与火炭母的使用浓度有关，其中高剂量的火炭母在改善肝损伤及抑制鼠伤寒沙门菌生长方面不如中、低剂量的火炭母效果好，可能是此药物作用范围较窄，超过最佳剂量后随着浓度升高药物作用效果反而下降了。

机体的固有免疫系统通过模式识别受体(PRR)识别病原体相关分子模式(PAMP)，可经过由IFN-β TIR结构域衔接蛋白联接的信号通路(TRIF依赖性通路)，激活TBK1复合物，进一步促进IRF3的活化与磷酸化[22]。当IRF3被磷酸化激活后易位到细胞核并启动IFN-Ⅰ的表达[23-24]。IFN是一类糖蛋白，有广谱的抗病毒作用，可激活免疫细胞、干扰病原体复制，提高IFN的产生可改善鼠伤寒沙门菌引起的疾病[25-26]。鼠伤寒沙门菌感染通常能导致强烈的炎症反应，伴随着炎症细胞因子和趋化因子的分泌，如TNF-α和IL-1β[27]。促炎细胞因子的生物合成和分泌与动物肝损伤相关，机体中TNF-α和IL-1β表达水平在一定程度上体现了机体中炎症反应的强弱[28]。Li等[29]研究结果表明，肉鸡感染鼠伤寒沙门菌后，空肠的TBK1、IRF3、IFN-α、IFN-γ含量均降低，而TNF-α、IL-1β水平增高。本研究同样发现小鼠感染鼠伤寒沙门菌后肝脏中P-TBK1与TBK1的比例显著降低，IRF3和P-IRF3的表达水平也明显下降，IFN的表达水平明显降低，而TNF-α和IL-1β的表达水平则显著升高。提示鼠伤寒沙门菌可能通过抑制TBK1的磷酸化及IRF3蛋白的产生和磷酸化，减少IFN的产生，降低机体抵御微生物感染的能力，增加受感染小鼠肝脏的炎症反应。中剂量的火炭母进行干扰后，显著提高了感染鼠伤寒沙门菌小鼠肝脏中的P-TBK1与TBK1的比例，激活产生IRF3和P-IRF3，诱导产生大量IFN，抑制TNF-α、IL-1β的表达；而火炭母低剂量组P-IRF3、IFN水平较模型组低，可能是浓度较低不足以激活TBK1-IRF3通路，而通过其他途径抑制沙门菌感染小鼠肝损伤；火炭母高剂量组IL-1β水平增高，可能是高浓度的火炭母口服液本身具有一定的肝毒性，影响其治疗效果，具体原因尚待进一步研究。Zhao等[30]研究结果表明，抗原加工相关转运体1(TAP1)可通过激活TBK1-IRF3介导的IFN-Ⅰ产生广泛的抗病毒活性，其作用机制与本研究结果相似，推测火炭母可能通过增强TBK1磷酸化以激活IRF3，诱导大量IFN的产生，发挥抗炎作用，抵御鼠伤寒沙门菌的侵害，从而发挥保肝作用。但火炭母是否通过TRIF途径、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)途径、干扰素基因刺激分子(STING)途径调控TBK1-IRF3通路还有待验证。

4 小 结

火炭母可通过上调TBK1-IRF3途径诱导IFN的产生发挥抗炎作用，改善鼠伤寒沙门菌诱导的小鼠肝损伤，以8 g/kg使用剂量效果最佳。