复合添加剂对解冻后奶牛性控冻精质量及受胎率的影响

许晓玲，白佳桦，肖霖力，秦玉圣，宋玉清，刘 彦

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

奶牛性控冻精可以按照实际生产需求繁育出更多的优良母牛，是良种快速扩繁的重要技术手段。特别是近年来随着分离技术的发展，性控精液X精子分离准确率为85%～95%[1]。人工授精后性控母犊率高达95.45%，与普通冻精47.37%的母犊率相比，优势特别明显[2]。但是，在性控冻精制作过程中需要对精液进行稀释、染色、流式分离、冷冻等体外操作，导致其在冻融后的精子活力、顶体完整率及受精率等重要指标方面显著低于常规冷冻精液[3]。同时，性控冻精普遍存在输精后受胎率不高的问题，因此限制了该项技术在奶牛特别是经产奶牛生产中的推广应用。

褪黑素(melatonin)是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素，其在生物节律、生殖、免疫、抗氧化等方面发挥着重要作用。多项研究表明，在冷冻精液稀释液中添加褪黑素可以显著提高解冻后精子活力、动力学相关参数[4-5]以及精子顶体膜、质膜的完整性[6]。前列腺素(prostaglandin，PGF2α)是存在于动物和人体中的一类由不饱和脂肪酸组成的、具有多种生理作用的活性物质，最早是在人精液中发现的，主要来自精囊；此后发现其存在于动物体睾丸、子宫、胎盘及卵巢等多种组织。研究表明，在人工授精前1～2 h，用输精管吸入2 mL PGF2α注射到子宫颈分叉处，可以提高奶牛输精后的受胎率[7]；在解冻后精液中添加1.5 mg/mL PGF2α也可显著提高奶牛的受胎率[8]。但褪黑素和前列腺素两者组合后对解冻后奶牛性控冻精的作用鲜见报道。鉴于此，本研究开展了以褪黑素、地诺前列腺素为主的精液复合添加剂对性控冻精解冻后精子活率、运动参数、顶体完整性、高能线粒体比例及受胎率的影响，以期为提高奶牛场良种覆盖率提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

褪黑素、碘化丙啶(PI)、Hochest 33342、FITC-PNA均购自Sigma公司；JC-1试剂盒购自Invitrogen公司；Steridyl®精液稀释液购自Minitube公司；地诺前列腺素(dinoprostin)购自辉瑞公司。

用于精液品质分析的牛性控冻精购自北京首农畜牧发展有限公司奶牛中心(308H017803、308H016683、11109693)；用于牛场输精试验所用性控冻精购自荷兰CRV奶牛育种公司(151HO03369、551HO03416)。

1.2 试验处理

从液氮中取出30支0.25 mL奶牛性控冻精细管，分为2组：试验组和对照组，每组15支，37 ℃水浴锅中解冻30 s。剪开细管封口，将精液加入到37 ℃预热的250 μL精液复合添加剂(试验组)或250 μL精液稀释液(对照组)EP管中，混匀。将混合物室温孵育0、2和4 h后，用于后续精液品质检测试验。试验组中褪黑素和地诺前列腺素的终浓度分别为24 ng/mL和1.5 mg/mL。

1.3 精液品质测定

1.3.1 性控冻精活率 取孵育后的性控冻精混合物100 μL，添加5 μL PI和5 μL Hochest 33342置于37 ℃水浴锅避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于荧光显微镜下观察，统计视野里的死精子数(红色)和总精子数(蓝色)，计算精子活率。每个样品取5个视野计算平均值。计算公式为：

精子活率(%)=(总精子数―死精子数)/总精子数×100%

1.3.2 精子顶体完整性 取孵育后的性控冻精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL FITC-PNA，置于37 ℃水浴锅避光孵育30 min。取出10 μL制片，置于荧光显微镜下观察，统计视野里的死精子数(红色)和总精子数(蓝色)，以及发生顶体反应或顶体破损精子数(绿色)，计算活精子中没有顶体反应的精子数占总精子数的比例。每个样品取5个视野计算平均值。计算公式为：

顶体完整率(%)=(总精子数-染绿色精子数-染红色精子数)/总精子数×100%

1.3.3 精子高能线粒体活性 取孵育后的性控冻精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL JC-1，置于37 ℃水浴锅避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于荧光显微镜下观察，统计高能线粒体(红色)的精子数占总精子数的比例。每个样品取5个视野计算平均值。

1.4 人工授精试验

从液氮中取出多支0.25 mL奶牛性控冻精细管，迅速置于37 ℃恒温水浴锅中解冻30 s，将37 ℃预热的复合添加剂(试验组)或精液稀释液(对照组)按照1∶1的比例添加到解冻后的性控精液中，用于发情周期正常的216头青年母牛(对照组101头、试验组115头)及子宫环境良好的82头头胎母牛(对照组26头、试验组56头)输精。输精时间严格控制在排卵前的3～5 h内进行。同时，通过直肠把握确定优势卵泡位置，采用子宫体深部输精，输精28 d后采用血检确定妊娠情况。

1.5 统计分析

试验数据应用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 复合添加剂对性控冻精精子品质的影响

2.1.1 复合添加剂对性控冻精活率的影响 通过对复合添加剂孵育0、2及4 h后的性控冻精进行PI和Hochest 33342 染色，染色情况见图1，其中PI染红色代表死精子，Hochest 33342染蓝色代表总精子。由表1可知，孵育0 h，试验组及对照组性控冻精活率分别为45.82%和44.68%，差异不显著(P>0.05)；孵育2 h，试验组性控冻精活率为39.03%，显著高于对照组(P<0.05)；孵育4 h，试验组及对照组性控冻精活率分别为21.19%和20.17%，差异不显著(P>0.05)。

图1 精子活率检测(400×)

表1 奶牛性控冻精经复合添加剂孵育后不同时间的精子活率

2.1.2 复合添加剂对性控冻精顶体完整性的影响 对复合添加剂孵育0、2及4 h后的精子顶体完整性进行检测，染色结果见图2，其中FITC-PNA染绿色代表发生顶体反应或顶体破损的精子，PI染红色代表死精子，Hochest 33342染蓝色代表总精子。由表2可知，孵育0 h，试验组和对照组精子顶体完整性分别为48.92%和48.31%，差异不显著(P>0.05)；孵育2 h，试验组精子顶体完整率为38.91%，显著高于对照组(P<0.05)；孵育4 h，试验组和对照组精子顶体完整性分别为26.62%和24.95%，差异不显著(P>0.05)。

图2 精子顶体完整性检测(400×)

表2 奶牛性控冻精经复合添加剂孵育后不同时间的顶体完整率

2.1.3 复合添加剂对性控冻精线粒体活性的影响 通过对复合添加剂孵育0、2及4 h后的精子线粒体活性进行染色，染色结果见图3，JC-1染红色代表高能线粒体精子，Hochest 33342染蓝色代表总精子。由表3可知，孵育0 h，试验组精液中高能线粒体活性精子比率为35.20%，与对照组间差异不显著(P>0.05)；孵育2和4 h，试验组精液中高能线粒体活性精子比率分别为32.76%和24.90%，均显著高于对照组(P<0.05)。

图3 精子线粒体活性染色(400×)

表3 奶牛性控冻精经复合添加剂孵育后不同时间的高能线粒体活性精子比率

2.2 复合添加剂对奶牛性控冻精受胎率的影响

将37 ℃预热的复合添加剂按照1∶1的比例添加到解冻后的性控精液中，分别用于青年奶牛和头胎奶牛的输精试验，输精后28 d采血进行早期妊娠诊断确定配种受胎情况，结果见表4。由表4可知，试验组青年奶牛和头胎奶牛受胎率分别为65.22%和48.21%，均显著高于对照组(P<0.05)。

表4 奶牛性控冻精添加复合添加剂后的受胎率

3 讨 论

3.1 复合添加剂对奶牛性控冻精品质的影响

奶牛性控冻精可根据牛场发展的需求较短时间内获得更多的优良母犊后代，从而实现养殖利润的最大化。随着流式细胞分离技术的不断发展，性控精子分离效率和准确率都在不断提高，生产成本也在不断降低。但由于性控冻精受精能力远低于常规冻精，因此在一定程度上限制了其在生产中的推广应用。研究表明，性控冻精受精能力低与其制备分选时染料、附加电荷、分离压力、高度稀释、冷冻、长时间体外操作等引起氧化应激产生大量活性氧(ROS)有关，大量的ROS改变了精子结构功能，使精子出现DNA片段化、脂质过氧化、顶体完整性与活力降低[9]，从而抑制了精子受精能力[10-13]。针对以上问题，不少研究者通过在精液冷冻保护液液中添加维生素、谷胱甘肽、半胱氨酸、海藻糖、褪黑素、槲皮素、白藜芦醇等抗氧化物来缓解冷冻精液的氧化损伤，效果显著。孙伟[14]研究表明，通过添加抗氧化剂(VE、SOD、CAT)可以明显提升奶牛分离X精子的活力和体外存活时间。但这些研究主要集中在冷冻保护剂中，在性控冻精分选中及分选后的研究相对较少。Li等[15]研究表明，在水牛精液中补充10-4mol/L褪黑素可以有效减少性控精液分选和冻融过程产生ROS引起的氧化损伤；褪黑素在精子冷冻中的作用机制可能是通过改变激酶的活性从而降低了精子的冷冻损伤[16-17]。Li等[18]研究表明，褪黑素主要是通过抑制凋亡和MT1受体来促进牛性控冻精的受精能力。Pang等[19]在解冻后的奶牛常规精液中添加10-5和10-3mol/L褪黑素可以显著增加精子顶体完整性、线粒体活性，显著降低胞内ROS水平。这与本试验在性控精液中的研究结果是一致的。本研究通过对解冻后性控冻精添加以褪黑素和地诺前列腺素为主的复合添加剂孵育2 h后，精子活率、顶体完整性、高能线粒体活性精子比率均显著增加。因此，复合添加剂中褪黑素作为强氧化剂，在精液冷冻、精液分选及精液解冻后都具有提高其活力、减少氧化应激的作用，为提高输精后的受胎率奠定了基础。

3.2 复合添加剂对性控冻精受胎率的影响

性控冻精解冻后存活时间短，输精后受胎率也比普通冻精低。因此，在生产实践中性控冻精的推广使用受到了一定限制，特别是在经产母牛中很少使用。与常规精液人工授精相比，性控冻精人工授精情期受胎率可降低15%～20%[20]。青年奶牛第1次使用性控冻精配种妊娠率为41.11%(761/1 851)，返情牛第2次配种妊娠率为36.52%(42/115)[21]。不同研究表明，用性控精液给奶牛进行人工授精后青年牛的受胎率显著高于经产母牛。吴洪等[22]研究表明，青年牛和成母牛性控冻精受胎率分别为55.60%(93/167)和48.20%(198/411)，两者差异显著。本研究中，青年奶牛的受胎率高于头胎奶牛，且复合添加剂组青年奶牛和头胎奶牛的受胎率分别为65.22%和48.21%，均显著高于对照组。复合添加剂主要成分是褪黑素和地诺前列腺素，褪黑素可以直接参与卵泡的发育与排卵，提高牛卵母细胞成熟率及胚胎的发育率[23-24]；在配种同时体外注射10-3～10-1mol/L褪黑素可以有效提高奶牛受胎率[25]。此外，在解冻后冻精及输精前的子宫颈中添加PGF2α均可提高奶牛的受胎率[7-8]。因此，复合添加剂促进性控冻精的受胎率不仅是因为减少了性控冻精的氧化损伤，提高冻精在生殖道的运动能力，还可能是因为促进了卵泡的及时排卵，增加了精卵结合的机会。

4 结 论

以褪黑素和地诺前列腺素为主的精液复合添加剂能够提高解冻后奶牛性控冻精的精子活率、顶体完整率、高能线粒体活性精子比率以及输精后的受胎率。