黔东南小香鸡MEF2C基因外显子多态性及其与体重、体尺性状的关联分析

周 迪，敖 叶，蒋桂荣，赵忠海，李 俊，杨 蓉，龚 菲，陈昌雪，沈 银，李 辉

(1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵阳 550018；2.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵阳 550025；3.遵义市畜牧渔业站，遵义 563000)

据国家统计局官方网站发布的最新统计公报显示，2021年全国肉类总产量8 887万t，其中禽肉产量2 380万t，同比增长0.8%，占肉类产量26.78%，仅次于猪肉59.59%的占比；禽蛋产量3 409万t[1]。因此，禽类肉蛋产品有着良好的发展前景。通常情况下，家禽的经济价值主要体现在屠宰性能和繁殖性能，产肉性能则是屠宰性能的另一种表现形式，然而产肉性能又与体重、体尺性状密不可分。肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因是MEF2基因家族一员，在肌肉沉积过程中扮演着重要角色，能够与大多数肌肉特异基因的启动子或增强子直接结合，从而启动或增强相关基因的表达[2-3]。研究发现，MEF2C基因发生突变，会使人群增加患2型糖尿病的风险[4]；MEF2C基因表达异常可增加人体患急性淋巴细胞白血病的可能[5]；MEF2C基因部分或完全缺失会使机体的生长发育严重迟缓[6]；MEF2C基因与南江黄山羊的生长发育具有密切关系[7]；MFE2C基因可通过结合肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)启动子的相关位点来调节肌纤维类型相互转换，实现对肌肉的正常生长及发育调控[8]；MSTN基因启动子与MEF2C基因同时参与了牛肌肉生长和分化的调控[9]；MEF2C基因5′-UTR变异可导致机体功能缺失从而出现严重的发育障碍[10]。然而目前关于MEF2C基因的研究主要集中在人类医学以及其他模式生物和大型家畜上，对于鸡的研究鲜见报道。黔东南小香鸡是贵州省独有的地方家禽品种，具有耐粗饲、抗逆性强、肉质优良、营养丰富等优点，但由于群体数量偏少，加之缺少科学的选育方案，群体近交频繁，导致黔东南小香鸡近交衰退现象日趋明显[11-13]。鉴于此，本研究以黔东南小香鸡为研究对象，选取MEF2C为候选基因，通过筛选试验群体中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，并与黔东南小香鸡的体重、体尺指标进行关联分析，以期获得具有遗传价值的标记位点，为黔东南小香鸡保种、育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

300日龄健康黔东南小香鸡由贵州省榕江县小香鸡保种场提供，其中母鸡146只、公鸡105只，自由饮水和采食，翅静脉采血，EDTA抗凝，冰盒带回实验室，―20 ℃保存备用。群体体重、体尺指标测量按照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823―2004)进行。

血液基因组DNA提取试剂盒、2×TaqMasterMix、DL2000 DNA Marker、GoldView Ⅰ型核酸染料均购自上海索莱宝生物科技有限公司。

1.2 基因组DNA提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒对血样进行DNA提取，利用微量紫外分光光度计进行DNA纯度和浓度检测，鉴定合格的样品于―20 ℃保存备用。

1.3 引物设计及合成

根据GenBank中鸡MEF2C基因预测序列(登录号:NC_052572.1)，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计20对特异性引物用于扩增MEF2C基因全部外显子区域，引物信息见表1。引物均由安徽通用生物系统有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR扩增及测序

PCR反应体系30 μL：2×TaqMasterMix 15 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度见表1)，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压130 V，时间20 min。对鉴定合格的PCR扩增产物送往安徽通用生物系统有限公司进行直接测序，测序结果利用DNAStar程序进行比对，并用GenBank上公布的参考序列(登录号：NC_052572.1)进行校正。

1.5 统计分析

利用Excel 2010对生长数据进行统计，利用SPSS 18.0软件中一般线性模型(GLM)、非配对等方差t检验方法对不同SNPs位点各基因型与鸡的体重、体尺性状进行关联分析，数据以平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 PCR扩增产物检测

利用20对特异性引物扩增MEF2C基因全部外显子区域，1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增产物长度与预期大小一致，条带清晰明亮，可进行下一步试验，部分结果见图1。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，MEF2C-18引物PCR扩增结果；4～6，MEF2C-19引物PCR扩增结果；7～9，MEF2C-20引物PCR扩增结果

2.2 SNP位点分析

利用DNAStar程序对测序结果进行比对，结果在黔东南小香鸡MEF2C基因外显子12中发现3个SNPs，在第1 819 bp处发生T→C突变，命名为g.1819 T>C，导致第607位氨基酸由异亮氨酸突变为苏氨酸，存在3种基因型：TT、CC、TC(图2A)；在第2 426 bp处发生T→C突变，命名为g.2426 T>C，导致第809位氨基酸由异亮氨酸突变为苏氨酸，存在2种基因型：TT和CC(图2B)；在第2 543 bp处发生C→T突变，命名为g.2543 C>T，导致第848位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，存在2种基因型：TT和CC(图2C)。

A，g.1819 T>C；B,g.2426 T>C；C,g.2543 C>T

2.3 遗传学分析

由表2可知，g.1819 T>C、g.2426 T>C和g.2543 C>T位点的优势基因型分别为CC、CC和TT，优势等位基因分别为C、C和T；χ2检验结果发现，3个SNPs位点在黔东南小香鸡群体中均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

表2 MEF2C基因SNPs位点基因型频率及基因频率

2.4 MEF2C基因多态性与黔东南小香鸡体重、体尺性状的关联分析

由表3可知，g.1819 T>C位点TC基因型个体体斜长、胸深和胫围均极显著高于TT和CC基因型(P<0.01)，CC基因型个体胸深和胫围显著高于TT基因型个体(P<0.05)；TC基因型个体体重极显著高于TT基因型(P<0.01)，显著高于CC基因型(P<0.05)；TC基因型个体胫长显著高于TT和CC基因型(P<0.05)，TT和CC基因型之间差异不显著(P>0.05)；TC基因型龙骨长显著高于TT基因型(P<0.05)，与CC基因型差异不显著(P>0.05)。g.2426 T>C位点TT基因型个体胫围极显著高于CC基因型(P<0.01)，其余性状指标在两种基因型间差异均不显著(P>0.05)。g.2543 C>T位点CC基因型个体胫围极显著高于TT基因型(P<0.01)，其余性状指标在两种基因型间差异均不显著(P>0.05)。通过对比分析发现，g.2426 T>C和g.2543 C>T位点互为连锁平衡位点。

表3 MEF2C基因多态性与黔东南小香鸡体重、体尺性状的关联分析

3 讨 论

MEF2C基因是一个广谱表达基因，在动物机体的多个组织中均能检测到表达，尤其是肌肉组织中[14]。王琴[15]研究报道，MEF2C基因在山羊多个组织中均能检测到表达，且存在4种不同的转录本。邱进等[16]研究指出，MEF2C基因启动子区多态性造成人获得性先天性心脏病的可能性增大。杨华婷等[17]研究报道，兴义鸭MEF2C基因启动子区的突变可能会使转录因子及结合位点发生改变，从而导致屠宰性状受到影响；兴义鸭MEF2C基因存在2种可变剪切体，且在腿肌和胸肌中的表达量不随日龄的增加而升高[18-19]。展召阳[20]研究显示，MEF2C基因多态性对黄牛的体重、体长、体高、胸围、坐骨端宽等多个性状存在显著影响。沈并兵[21]研究报道，在南江黄羊MEF2C基因多个外显子中存在多个SNPs位点，且对山羊生长性状有显著影响。因此，无论是MEF2C基因的启动子区还是其他区域的突变，都对动物机体存在着一定的影响。本研究利用PCR扩增技术获得了黔东南小香鸡MEF2C基因全部外显子序列，并从中发现了3个SNPs，与体重、体尺性状关联分析结果表明，g.1819 T>C位点TC基因型对黔东南小香鸡的体重及体尺性状多个指标存在极显著或显著影响，而g.2426 T>C和g.2543 C>T位点仅对胫围有极显著影响，本研究结果与前人研究结果有一定的相似性，说明MEF2C基因多态性确实对黔东南小香鸡体重、体尺指标有影响，这3个SNPs可以作为黔东南小香鸡辅助选育参考位点，尤其是g.1819 T>C位点。

赵忠海[22]研究报道，在兴义鸭MEF2C基因中存在多个突变位点，但未详细介绍这些突变位点所在的具体外显子。王兴东等[23]研究报道，牦牛MEF2C基因与普通牛相比存在2个碱基变异和一段24 bp缺失，且2个碱基变异均引起了所编码氨基酸的改变。Juszczuk-Kubiak等[24]对不同牛品种的MEF2C基因多态位点进行筛选时，仅在启动子及内含子区域发现5个SNPs位点。展召阳[20]研究报道，在秦川牛、郏县红牛、德南牛和夏郏牛4个黄牛品种中均仅在MEF2C基因内含子区发现4个SNPs位点。师新彩[25]在兴义鸭MEF2C基因的外显子中未发现多态位点。本研究中，仅在黔东南小香鸡外显子12中发现3个SNPs，其余外显子中均未发现，推测MEF2C基因外显子区域的保守性较强；通过χ2检验结果发现，3个SNPs位点均偏离Hardy-Weinberg平衡状态，这可能是人为过度干预黔东南小香鸡品种选育，导致品种间长期频繁近交，造成群体间遗传距离较近，进而种间样本数量较小，也有可能是黔东南小香鸡在独特的生长环境中经过自然选择进化的结果。但无论是哪种原因所致，加强对地方品种的保护、开发和研究显得尤为重要，今后本课题组将进一步围绕黔东南小香鸡核心主产区，加大样本量进行深入研究，进一步丰富黔东南小香鸡MEF2C基因研究成果，为该品种的保护、开发和利用提供理论支撑。

4 结 论

黔东南小香鸡MEF2C基因外显子12中存在3个SNPs位点：g.1819 T>C、g.2426 T>C和g.2543 C>T，对黔东南小香鸡体重、体尺性状均存在一定的影响，其中g.1819 T>C位点可以作为黔东南小香鸡分子标记辅助选育参考位点。