信阳红红茶的酚类成分及抗氧化能力分析

马健，徐成成 ，任小盈，马冰凇，4，马存强，周斌星

（1.信阳农林学院，河南 信阳 464000；2.云南农业大学茶学院，云南 昆明 650201；3.聊城高级财经职业学校，山东 聊城 252000；4.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）

红茶是以适宜的茶树鲜叶 [Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]为原料，经萎凋、揉捻（切）、发酵、干燥等一系列工艺加工而成的全发酵茶叶类型，占茶叶总产量的78%左右[1]。我国红茶按照加工方法分为小种红茶、工夫红茶和红碎茶等不同品类。祁红、滇红、宁红、宜红均是我国著名的工夫红茶。信阳地处东经114.06°，北纬32.125°，属亚热带向暖温带过渡区，为我国最北的茶叶产区之一，主要采摘春季和夏季茶树鲜叶进行信阳毛尖等烘青绿茶的生产。自2010年始，信阳茶企尝试以信阳群体种夏、秋季茶树鲜叶为原料，参照《红茶第2部分：工夫红茶》[2]进行“信阳红”红茶的生产。信阳红红茶因其具有外形条索紧细、色泽棕润多金毫、内质汤色红亮、香气甜香持久、滋味醇厚甘爽、叶底嫩匀红亮的品质特征[3-4]，广受国内外消费者的欢迎。

茶多酚（tea polyphenols）占茶树鲜叶干物质重30%左右[5]，主要包括儿茶素（catechins）、黄酮醇类（flavonols）、黄酮类（flavonoids）、花青素类（anthocyanins）和酚酸类（phenolic acids）等[6]。由于加工工艺不同，绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶六大类型茶叶中酚类成分分布存在显著差异[7-9]。在红茶加工中茶多酚在多酚氧化酶作用下氧化聚合形成茶黄素、茶红素和茶褐素等茶色素，并受到发酵程度和鲜叶内含成分等因素的影响[10]。Guo等[11]和Zhang等[12]研究显示红茶中酚酸、黄酮类、儿茶素等酚类成分与抗氧化、降血糖、降血脂等生物学活性存在一定相关性。目前关于信阳红红茶品质成分与生物学活性的相关研究相对较少。至今尚不明确信阳红红茶等工夫红茶中酚类成分分布及其对体外抗氧化能力的影响。

本文采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法对9个信阳红红茶茶样中的酚类化合物、嘌呤碱、游离氨基酸总量等品质成分进行测定，并分别进行铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）、DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除能力（hydroxyl radical scavenging ability，HSA）和超氧阴离子自由基清除能力（superoxide anion radical scavenging ability，SSA）等体外抗氧化能力的测定，通过多元统计学分析方法探究信阳红红茶中酚类成分分布及其对抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

信阳市浉河区天云山茶场以当地群体种同一规格茶树鲜叶加工生产的信阳红红茶样共9个，编号分别为XYH-1～XYH-9，-20℃下密封保存。（+）-儿茶素（catechin，C）、（+）-没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、（-）-表儿茶素（epicatechin，EC）、（-）-表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、（-）-儿茶素没食子酸酯（catechin galllate，CG）、（-）-表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、（-）-没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子酸、鞣花酸、水解单宁（1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1，4，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose） 标准品（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；槲皮素、山奈酚、杨梅素、芦丁、花旗松素、木犀草素标准品（纯度≥98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡碱、可可碱、茶标准品（纯度≥98%）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[（2，4，6-tri（2-pyridyl）-1，3，5-S-triazine，TPTZ）]、1，1-二苯基-2-苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，trolox）、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）]：美国 Sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司；羟自由基清除能力检测试剂盒、超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司。

Heraeus Fresco17高速离心机：美国Thermo Fisher公司；JXFSTPRP-24研磨仪：上海净信科技科技有限公司；TU-1901紫外-可见分光光度计：北京普析技术科技有限公司；Multiskan FC型酶标仪：美国Thermo Scientific公司；1200型HPLC仪：美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 主要品质成分分析

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》进行茶叶中水分的测定。采用福林酚比色法，以没食子酸为参照测定茶叶中的茶多酚含量[13-14]。采用蒽酮试剂在620 nm波长下进行茶叶中可溶性糖总量的测定[14-15]。游离氨基酸总量测定采用茚三酮比色法[16]。总黄酮含量以芦丁为参照，采用三氯化铝比色法进行测定[17-18]。茶叶中茶黄素、茶红素和茶褐素等3种茶色素含量采用紫外-可见分光光度计在380 nm波长下进行系统分析[19]。

1.2.2 茶汤浸提

茶样经研磨仪研磨，40目筛网过筛后，-20℃保存备用。称取1.0g茶叶研磨样品，加入40mL甲醇和4mL盐酸于圆底烧瓶85℃回流浸提90 min，冷却过滤后，用甲醇定容至50 mL，0.45 μm尼龙滤膜过滤后用于HPLC 检测[20]。

1.2.3 酚类化合物和嘌呤碱的HPLC检测

采用Agilent1200型HPLC仪连接Poroshell 120 EC-C18色谱柱（100×4.6 mm，2.7 μm）和 C18保护柱（10×4.6 mm，5 μm），对9个红茶样中的8种儿茶素、6种黄酮类、2种酚酸、水解单宁、3种嘌呤碱等活性成分含量进行定量检测[20-21]。流动相A为0.261%磷酸、5%乙腈，流动相B为80%甲醇；洗脱梯度程序：0 min，B相10%；10 min，B相线性增加至 45%；22 min，B 相线性增加至65%；25.9 min，B相线性增加至100%；29 min，B相保持100%；30 min，B相线性减少至10%；36 min，B相保持为10%。流速为0.8 mL/min。柱温为30℃；0～20 min检测波长为280 nm；20 min～36 min检测波长为360 nm；进样体积为 2 μL。

1.2.4 体外抗氧化能力测定

1.2.4.1 铁离子还原能力

0.05g信阳红红茶样与1mL80%乙醇混合，于60℃，200 W～300 W条件下超声提取30 min。12 000 r/min离心10 min后，取上清液。以抗氧化剂trolox为参照，采用微板法在590 nm波长下的进行FRAP检测，计算公式如下。

式中：X1为 trolox 物质的量，nmol；Y1为 OD590；V为提取液体积，1mL；V1为反应体系中样品体积，0.005mL；W为茶样干重，g；D为稀释倍数。

1.2.4.2 DPPH自由基清除能力

0.05 g信阳红红茶样与1 mL 80%甲醇提取液混合，进行冰浴匀浆。12 000 r/min离心10 min，取上清液。以抗氧化剂trolox为参照，采用微板法在517 nm波长下进行DPPH自由基清除能力的检测，计算公式如下。

式中：X2为 trolox 的浓度，μg/mL；Y2为 DPPH 自由基清除率，%；V为提取液体积，1mL；V1为反应体系中样品体积，0.150 mL；W为茶样干重，g；D为稀释倍数。

1.2.4.3 ABTS+自由基清除能力

0.05 g信阳红红茶样与1 mL 80%甲醇提取液混合，进行冰浴匀浆。12 000 r/min离心10 min后，取上清液。以抗氧化剂trolox为参照，采用微板法在734 nm波长下进行ABTS+自由基清除能力的检测，计算公式如下。

式中：X3为 trolox的浓度，μg/mL；Y3为 ABTS+自由基清除率，%；V为提取液体积，1 mL；V1为反应体系中样品体积，0.010 mL；W为茶样干重，g；D为稀释倍数。

1.2.4.4 羟基自由基清除能力

取0.1 g茶样与1 mL蒸馏水混合，进行冰浴匀浆。12 000 r/min离心10 min后，取上清液。采用微板法在510 nm下进行羟基自由基清除能力的检测。

1.2.4.5 超氧阴离子自由基清除能力

取0.1 g茶样与1 mL提取液混合，进行冰浴匀浆。12 000 r/min离心10 min后，采用微板法在570 nm波长下测定信阳红红茶上清液的超氧阴离子自由基清除能力。

1.3 数据处理与分析

每个茶样进行3次测定。数据采用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件进行数据分析。

2 结果分析

2.1 信阳红红茶品质成分的单因素方差分析

20个标准品和9个信阳红红茶的HPLC色谱图如图1所示。

图1 20个标准品和9个信阳红红茶样的高效液相色谱Fig.1 HPLC profiles of 20 standards and 9 Xinyanghong black tea samples

由图1可知，9个信阳红红茶中均能检出7种儿茶素（C、EC、EGC、EGCG、EGC、GCG 和 CG）、6 种黄酮类（芦丁、杨梅素、花旗松素、槲皮素、木犀草素和山奈酚）、2种酚酸（没食子酸和鞣花酸）和2种嘌呤碱（咖啡碱和可可碱）。所有信阳红茶样中均未检出GC，部分样品中未能检出茶碱。这与两者在茶叶中含量偏低有关[22]。红茶萎凋和酶促发酵过程中儿茶素含量呈显著降低趋势[22-24]，因而GC在信阳红红茶中未能检出，其他儿茶素也明显低于绿茶等未发酵茶叶类型。

9个信阳红红茶中的儿茶素、黄酮类、酚酸、嘌呤碱、茶色素等品质成分含量如表1所示。

表1 9个信阳红红茶中品质成分含量及其差异Table 1 Content and differences of quality components in 9 Xinyanghong black tea samples

续表1 9个信阳红红茶中品质成分含量及其差异Continue table 1 Content and differences of quality components in 9 Xinyanghong black tea samples

儿茶素总量为 C、EC、EGC、ECG、GCG、EGCG 和CG，由表1可知，7种儿茶素含量的总和；酯型儿茶素含量为ECG、GCG、EGCG和CG等4种酯型儿茶素含量的总和；非酯型儿茶素含量为C、EC和EGC3种非酯型儿茶素含量的总和。9个信阳红红茶中部分茶样之间的茶多酚、3种茶色素（茶黄素、茶红素和茶褐素）、7种儿茶素、没食子酸、3种黄酮类化合物（花旗松素、槲皮素和山奈酚）、可可碱和水解单宁等品质成分存在极显著性（P＜0.001）差异；而鞣花酸、芦丁、山奈酚等酚类成分存在显著性（P＜0.01）差异。另外，游离氨基酸、可溶性糖、杨梅素、山奈酚和咖啡碱等成分含量保持稳定，无显著性（P＞0.01）差异。尽管本研究信阳红茶采用统一规格的秋季茶树鲜叶加工而成，而发酵程度造成了红茶中茶多酚、茶色素、儿茶素以及没食子酸等酚类成分上的差异[25]。相对而言，芦丁、花旗松素、山奈酚等黄酮类化合物和鞣花酸等酚类成分受发酵程度的影响较小。

2.2 信阳红红茶的酚类成分以及嘌呤碱等品质成分含量

酚类物质是茶叶中主要呈味物质和功效成分。产地、茶树品种和加工工艺等因素均影响红茶的儿茶素、黄酮类和酚酸等酚类成分，有助于红茶的产地识别和溯源。不同产地工夫红茶中的EGCG、芦丁、奎宁酸、茶黄素等代谢物存在显著差异[26]。Yu等[27]研究发现春季不同加工时期内工夫红茶中品质成分的变化规律。秋季茶树鲜叶中儿茶素含量是春茶的1.3倍，特别是EGCG、ECG等酯型儿茶素等，这一定程度上增强了绿茶的苦味和收敛性[28]。相对而言，秋季茶树鲜叶更适用于红茶的加工生产[29]。较春季茶树鲜叶加工而成的工夫红茶，信阳红红茶中保留较多的茶多酚、儿茶素、黄酮类、酚酸等酚类成分。信阳红红茶中不同品质成分的平均含量及范围，如表2所示。

表2 信阳红红茶中不同品质成分的平均含量及范围Table 2 Average content and ranges of various quality components in Xinyanghong black tea samples

续表2 信阳红红茶中不同品质成分的平均含量及范围Continue table 2 Average content and ranges of various quality components in Xinyanghong black tea samples

在信阳红红茶的儿茶素类中，ECG平均含量最高，一般为（11.95±3.20）mg/g；其次为 EGCG 和 EC 平均含量分别为（9.30±1.68）mg/g和（7.55±1.60）mg/g。EGC 含量为（6.09±3.12）mg/g。在 95%置信范围内，茶多酚含量为56.34 mg/g～63.22 mg/g；总黄酮含量为26.70 mg/g～29.07 mg/g；总儿茶素含量为37.08 mg/g～43.71 mg/g，并以酯型儿茶素为主，含量为22.56 mg/g～26.34 mg/g；没食子酸为红茶中的主要酚酸类化合物，其含量在4.59 mg/g～5.01 mg/g；芦丁、花旗松素、木犀草素和杨梅素为信阳红红茶中的主要黄酮类成分，其含量分别为 1.39 mg/g～1.79 mg/g、0.59 mg/g～0.74 mg/g、0.53 mg/g～0.75 mg/g 和 0.36 mg/g～0.44 mg/g；咖啡碱为主要的嘌呤碱类物质，不同红茶茶样之间无显著（P＞0.01），含量为 37.89 mg/g～39.87 mg/g。

2.3 信阳红红茶体外抗氧化能力的单因素方差分析

本文采用微板法分别检测分析了9个信阳红红茶的FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、HSA和SSA等体外抗氧化能力，结果见图2。

图2 9个信阳红红茶茶样的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of 9 Xinyanghong black tea samples

图2显示部分信阳红红茶之间的FRAP、DPPH自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力存在显著性（P＜0.01）差异，这可能主要与红茶的酚类成分分布有关。而ABTS+自由基清除能力和羟基自由基清除能力无显著性差异。绿茶和红茶为世界范围内主要的消费茶叶类型，与绿茶相比，红茶的体外抗氧化能力较低，而体外抗氧化能力较高，这与绿茶中丰富的酚类成分以及小肠对酚类化合物的吸收率较低有关[30-31]。信阳红红茶的体外抗氧化能力符合这一规律。信阳红红茶的FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率分别为（919.73±138.27）μmol trolox/g、（421.38±9.15）mg trolox/g、（223.70±9.99）mg trolox/g、（57.71±2.23）%和（36.00±3.25）%，表现出一定的体外抗氧化能力。信阳红红茶的ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除能力相对稳定，受茶树鲜叶质量和加工工艺等因素的影响较小。在95%置信范围内，ABTS+自由基清除能力和羟基自由基清除能力分别为219.75 mg/g～227.66 mg/g和56.82%～58.59%。

2.4 酚类成分与抗氧化能力的相关性分析

本文通过SPSS软件采用双变量相关性分析探究了信阳红红茶中茶多酚、总黄酮、游离氨基酸、EGCG、ECG、没食子酸等成分含量与FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力等抗氧化能力的相关性，Person相关性系数详情见表3。

表3 信阳红红茶中品质成分与抗氧化能力的Person相关性系数Table 3 Person's correlation coefficient of quality component with antioxidant ability of Xinyanghong black tea

如表3所示，FRAP、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力之间存在显著（P＜0.05）或高显著（P＜0.01）相关性，羟基自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力之间及其与FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之间均不存在显著（P＞0.05）正相关性。酚类成分，如 EC、CG、EGCG、没食子酸、杨梅素等，以及茶黄素、游离氨基酸、可溶性糖与FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力存在显著（P＜0.05）或高显著（P＜0.01）正相关性；相反，茶红素、茶褐素以及花旗松素与FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力存在显著（P＜0.05）负相关性。而嘌呤碱和其他黄酮类化合物与抗氧化能力相关性不大。总的来说，信阳红红茶的体外抗氧化能力主要受到酚类成分和茶黄素、茶红素等茶色素的影响。儿茶素类和没食子酸是信阳红红茶中的主要抗氧化成分，均与FRAP、DPPH自由基清除能力或ABTS+自由基清除能力有显著（P＜0.05）或高显著（P＜0.01）正相关性，Person相关性系数最高分别为0.769、0.861、0.834和 0.759。特别是 EGCG （r=0.853，0.674和0.861）、EC（r=0.834，0.655 和 0.786）与 FRAP、ABTS+自由基清除能力和DPPH自由基清除能力等抗氧化能力存在高显著（P＜0.01）正相关性。ECG在一定程度上能提高信阳红红茶的DPPH自由基清除能力。芦丁、杨梅素等黄酮类化合物含量的相对稳定对信阳红红茶的体外抗氧化能力的影响有限。信阳红红茶中茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖以及儿茶素、黄酮类化合物、嘌呤碱均与羟基自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力无显著（P＞0.05）相关性，影响红茶中抗氧化能力的活性成分值得进一步研究。

3 讨论与结论

信阳红红茶中共检出 C、EC、EGC、CG、ECG、GCG和EGCG 7种儿茶素，芦丁、杨梅素、花旗松素、槲皮素、木犀草素和山奈酚6种黄酮类化合物，和没食子酸、鞣花酸等酚类成分，以及咖啡碱、可可碱、茶碱等嘌呤碱。确定ECG为主要的儿茶素类型，其平均含量为（11.95±3.20）mg/g；芦丁为主要的黄酮类化合物，其含量为1.39 mg/g～1.79 mg/g；没食子酸的含量为4.59 mg/g～5.01 mg/g。

单因素方差分析显示部分信阳红红茶茶样之间茶多酚、3种茶色素（茶黄素、茶红素和茶褐素）7种儿茶素、没食子酸、3种黄酮类（即：花旗松素、槲皮素和山奈酚）、可可碱和水解单宁含量存在极显著性（P＜0.001）差异，以及FRAP、DPPH自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力存在显著性（P＜0.01）差异。在95%置信度区间，FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率分别为（919.73±138.27）μmol trolox/g、（421.38±9.15）mg trolox/g、（223.70±9.99）mg trolox/g、（57.71±2.23）%和（36.00±3.25）%。双变量相关性分析显示了儿茶素、没食子酸等酚类成分以及茶黄素为信阳红红茶中的主要抗氧化成分，与FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力均存在显著（P＜0.05）或高显著（P＜0.01）正相关性。确定 EGCG、EC、ECG等儿茶素为影响红茶体外抗氧化能力的主要抗氧化活性成分。

本文采用HPLC等方法初步探明了信阳红红茶中的酚类成分构成以及抗氧化能力差异，并通过双变量相关性分析揭示了酚类成分与抗氧化能力的相关性，为工夫红茶的分类比较研究提供了科学依据。