UPLC-MS-MS法同时测定鸡肉食品中37种兽药残留

黄华，谢文东，谷雨，孟照琦，孙元洁，杜洪淼，孙娅娜，康帅

(北京市产品质量监督检验院，北京，101300)

随着人们对鸡肉食品由需求型向质量型的转变，鸡肉食品中的兽药残留已逐渐成为全世界关注的焦点。兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而，由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。滥用兽药极易造成鸡肉食品中有害物质的残留，这不仅对人体健康造成直接危害，而且对养殖业的发展和生态环境也造成极大危害。我国农业部在2003年(265)号公告中明文规定，不得使用不符合《兽药标签和说明书管理办法》规定的兽药产品，不得使用《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》所列21类药物及未经农业部批准的兽药，不得使用进口国明令禁用的兽药，畜禽产品中不得检出禁用药物。但事实上，养殖户为了追求最大的经济效益，将禁用药物当作添加剂使用的现象相当普遍，如饲料中添加盐酸克仑特罗(瘦肉精)引起的猪肉中毒事件等。在养殖过程中，普遍存在长期使用药物添加剂，随意使用新或高效抗生素，大量使用医用药物以及重复使用几种商品名不同但成分相同药物的现象。所有这些因素都造成药物在体内过量积累，导致兽药残留。

不同药物在化学性质上有很大差别，现有的药物残留分析方法一般是按照化学结构类似的原则，开发同种族药物的检测方法，同时针对多类药物的检测分析方法较少，而现有分析方法能同时分析的药物种类较少，不能满足当前兽药种类不断增加，分析通量不断提高的需求。随着超高效液相色谱串联质谱[1-6]技术的快速发展，鸡肉食品中兽药多残留检测范围已逐步从单一类别发展为多种不同类别兽药的同时定性与定量分析。

本文建立了一种全新的以QuEChERS为样品前处理技术与超高效液相色谱法-串联质谱法(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS)[7-11]有机结合，快速测定鸡肉食品中37种兽药残留的检测方法，以期为鸡肉食品中兽药残留的检测与监控提供依据。

1 实验方法

1.1 仪器和试剂

UPLC-MS-MS检测器质谱联用仪、DISQUETM萃取管(50 mL，内含4 g MgSO4、1 g NaCl、1.5 g柠檬酸钠)，美国Waters公司；3-18K型高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；涡旋混合器，美国Thermo公司；OA-SYSTM型氮吹仪，美国Organomation公司；CQ25-12D型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q Academic 超纯水系统，美国MilliPore公司；C18填料、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)填料、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)，天津博纳艾吉尔公司。

乙腈、甲醇，HPLC级，美国Fisher公司；甲酸、乙酸铵，HPLC级，德国CNW公司；正己烷、乙酸，分析纯。

大环内酯类标准品：盐酸克林霉素(lindamycin,DA)、替米考星(tilmicosin，TM)；青霉素类标准品：青霉素V(penicillin V， PVC)、泰勒菌素(tylosin，TL)、氨苄西林(ampicilin，AMP)、双氯青霉素(dicloxacillin，MDIC)、四环素(tetracydine，TE)、强力霉素(doxycydine， DOXY)、土霉素(oxytetracydine，OTC)；苯并咪唑类标准品：阿苯达唑砜(albendazone sulfone，ASF)、阿苯达唑氨基砜(albendazole-2-2-aminosulfone hydrochloride，AASF)；磺胺类标准品：磺胺地索辛(sulfadimethoxine，SDM)、磺胺噻唑(sulfathiazole，ST)、磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，SMX)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine，SCP)、磺胺对甲氧嘧啶(sufameter，SMT)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SMR)、磺胺吡啶(sulfapyridine， SPD)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine，SMM)、磺胺甲二唑(sulfamethizol，SM)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxypyridazine，SMPD)、磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine，SDMD)、磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline、SQX)、磺胺二甲异恶唑(sufisoxazole，SSZ)；喹诺酮类标准品：二氟沙星(difloxacin，DIF)、奥比沙星(orbifloxacin，ORB)、司帕沙星(sparfloxacin，SPA)、沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、氟罗沙星(flerofloxacin，FLE)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)、马波沙星(3-pyriolidinol，MAR)、丹诺沙星(danofloxacin，DAN)、培氟沙星(pefloxacin，NOR)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、依诺沙星(enoxacin，ENO)，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 标准工作液的配制

将各标准品用甲醇配制成1 μg/mL的标准储备液，并根据需要用甲醇稀释成适当质量浓度的混合标准工作溶液，于棕色储存瓶中保存。

1.3 UPLC-TQS条件

1.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；柱温40 ℃；样品室温度10 ℃；进样体积10 μL；流速0.3 mL/min；流动相：甲醇(A)和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液(B)；梯度洗脱程序：0～14 min，10%A～95%A；14～17 min，95%A～95%A；17～18 min，95%A～10%A；18～20 min，10%A～95%A。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)：正离子模式；毛细管电压3.3 kV；离子源温度150 ℃；锥孔反吹气流量150 L/h；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气流量900 L/h；多反应监测(multi-reaction monitoring mode，MRM)模式。定性分析时每种药物选择1个母离子和2个子离子，试样中若目标物的色谱峰保留时间与标准品一致(偏差<±2.5%)，所选择离子均出现，且离子相对丰度比与标准品中对应离子的相对丰度比一致，容许偏差满足2002/657/EC 的要求，则判定为样品中存在该待测兽药，各药物质谱条件见表1。

1.4 样品前处理

准确称取鸡肉组织试样2.0 g，加入DISQUETM萃取管中，加入20 mLV(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1混合液，涡旋充分混合，超声提取10 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，移取上清液10 mL于离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋振荡混匀，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃除正己烷层，下层提取液氮气流吹干，加入1 mLV(乙腈)∶V(乙酸铵)=1∶9混合液溶解残渣，滤膜过滤至进样瓶中，测定分析。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS-MS条件的优化

实验发现, 在流动相中加入体积分数0.1%甲酸来控制流动相的pH，加入挥发性电解质乙酸铵可以在保持较好分离度的前提下获得理想的色谱峰、减小加合峰、增大分子离子峰的峰强度。本文分别对比了0.1%甲酸乙酸铵-甲醇和0.1%甲酸乙酸铵-乙腈为流动相，发现0.1%甲酸乙酸铵-乙腈为流动相目标物的响应值比0.1%甲酸乙酸铵-甲醇为流动相时低, 可能因为乙腈降低了目标化合物的离子化效率, 使其响应值亦随之降低。

对50 μg/L的各药物的单一标准溶液分别在ESI+和ESI-离子化模式下进行自动全扫描。实验表明，所有目标分析物在ESI+电离方式下采用[M+H]+，各药物的检测离子信息见表1。

表1 37种药物的部分质谱参数Table 1 MS paramenters of 37 drugs

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

动物组织中兽药残留常用的提取溶剂包括乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、缓冲溶液，或者有机溶剂添加一定比例的酸或碱等。选取总体回收率较差的四环素、青霉素V、阿苯达唑砜、培氟沙星4种化合物作为依据，样品在加标量为5 μg/kg的情况下，以样品加标回收率为指标，分别考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷为提取溶剂对鸡肉中4种兽药的提取效率。

如图1所示，使用甲醇、乙腈、二氯甲烷作为提取溶剂，兽药的回收率普遍高于乙酸乙酯和正己烷；但二氯甲烷作为提取溶剂时，提取液中杂质较多，故初步选定甲醇、乙腈作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂的回收率(n=6)Fig.1 Recovery of different extract solvent(n=6)

但由于兽药种类不同，性质各异，因此使用单一溶剂提取不能完全兼顾所有待测兽药的回收率，为了兼顾多兽药同时检测的需要，进一步提高提取回收率，考察了不同比例的混合溶剂对兽药的提取回收率。考虑到37种药物的快速筛查需要通用、快速、回收率优化的前处理方法，考察前处理提取方法既能够满足提取回收率70%～120%的实验要求，又能够有效地净化基质中的干扰，选取总体回收率较差的四环素、青霉素V、阿苯达唑砜、培氟沙星4种化合物作为依据，样品在相同加标量5 μg/kg的情况下，分别考察了甲醇∶乙腈和1%乙酸甲醇∶乙腈不同浓度比例下兽药的提取回收率。结果如图2所示。使用V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1混合液作为提取溶剂，兽药的回收率较高，所以选定V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1的混合溶剂作为提取溶剂。

图2 不同混合提取溶剂的回收率(n=6)Fig.2 Recovery of different compound extract solvent(n=6)

2.2.2 净化条件的优化

本实验采用QuEChERS的提取方法, 根据鸡肉食品的基质特点，样品中的脂类物质会干扰目标化合物的检测。而N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA)通常用于去除提取液中的脂肪酸、有机酸、糖和酚类等, 还可吸附部分极性色素, 且在无水的条件下能发挥更好的效果；C18及GCB都具有良好的除脂能力, 因此选用PSA、C18和GCB作为净化吸附剂。考察了PSA、C18、GCB，均为50～100 mg这3种常用的吸附剂材料及起脱水作用的无水MgSO4(100～500 mg)对四环素、青霉素V、阿苯达唑砜、培氟沙星的吸附净化作用，结果如图3所示。

图3 不同净化条件的净化效果(n=6)Fig.3 Clean-up effect of different clean-up methods(n=6)

虽然GCB具有一定的脂肪吸附能力，但同时对于目标化合物也有一定的吸附，导致回收率偏低，所以本文选用100 mg PSA、100 mg C18为净化剂组合，对样品基质干扰最小且回收率最高，可以达到37种药物较好的前处理提取净化效果，目标化合物的回收率均在70%以上。

2.3 线性关系和检出限

分别准确移取适量的37种兽药混合标准工作溶液，添加到2.0 g空白鸡肉中，按1.4的前处理方法，制得目标药物含量为1、2、5、10、20、50 μg/kg的系列空白添加试样，然后上机测定，以目标组分峰面积为纵坐标，相应的添加含量为横坐标，绘制标准曲线。在1～50 μg/kg各组分峰面积与相应的添加含量呈线性关系，相关系数为0.984 1～0.999 4，结果见表2。

采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据特征离子色谱峰的信噪比(S/N)>3为检出限(limit of determination, LOD)，S/N>10为定量限(limit of quantitation, LOQ)，得到37种药物的LOD为0.5 μg/kg，LOQ为1 μg/kg。

2.4 回收率与精密度

取1、5、10、20 μg/kg的阳性添加试样，按照1.4的步骤操作，每一个添加水平重复6次，计算回收率，以相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)计算精密度。结果表明，阳性添加1、5、10、20 μg/kg平均回收率为71%～109%，RSD为1.7%～14.7%，结果满足要求，见表2和电子增强出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029328)。

表2 37种药物线性回归方程、相关系数及加标回收率(n=6)Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and adding standard recovery of 37 drugs(n=6)

续表2

3 结论

本文将在蔬菜水果农药残留分析中采用的样品处理技术QuEChERS引入到鸡肉中兽药多残留的分析，通过优化样品预处理及色谱质谱测定条件，建立了UPLC-MS-MS同时测定鸡肉中37种兽药的方法。该方法样品前处理成本低廉、简便快速、灵敏可靠，适合对鸡肉中磺胺类、喹诺酮类、苯并咪唑类、四环素类、大环内酯类和青霉素类药物残留进行确证和定量测定。