环氧二十碳三烯酸对老年慢性心力衰竭大鼠的保护作用及机制

刘运阳 欧奇林 王素侠 刘阳

(南华大学附属第二医院心血管内科，湖南 衡阳 421000)

慢性心力衰竭(CHF)是由于多种原因导致心室功能及结构异常引起的心室射血功能减少的临床综合征〔1〕，是多种心血管疾病的终末期表现。CHF主要表现为心肌收缩功能和心输出量下降，机体组织供氧和代谢的血液供应减少〔2〕。CHF的发病率逐年上升，并且临床预后差、死亡率高，5年死亡率与癌症患者接近，严重影响患者的生活质量〔3〕。环氧二十碳三烯酸(EETs)作为花生四烯酸经细胞色素P450代谢途径的代谢产物，可扩张血管及降低炎性反应等，在高血压、心肌缺血及肥胖等方面都起着重要的治疗作用〔4〕。目前关于EETs对CHF的治疗作用鲜有报告。本研究探讨EETs对老年CHF大鼠的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠60只，22～24周龄，雌雄各半，体重200～300 g，购自南华大学实验动物部，生产许可证号SCXK(湘)2004-0009。实验开始前先适应性喂养1 w，动物房温度20～26℃，相对湿度45%～55%，昼夜时间12 h/12 h，用标准大鼠颗粒饲料喂养，自由饮用纯净水。

1.2药品试剂及仪器 EETs由美国Cayman Chemical公司提供；注射用盐酸阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司，批准文号H33021980；白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α购自西门子医学诊断产品上海有限公司；原位末端标记法(TUNEL)试剂盒购自德国Roche公司；二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白酶K购自德国Merck公司；磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体均购自美国Abcam 公司生产；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、兔抗鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗大鼠IgG、电化学发光(ECL)Prime 蛋白印迹试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。主要仪器：Vevo 2100 超高分辨率小动物多普勒超声影像系统购自加拿大Visualsonics 公司；-80℃超低温冰箱购自青岛海尔电冰箱有限公司；RM2245型石蜡切片机、ASP300S型全自动脱水机购自德国 Leica公司；BX53型显微镜购自日本Olympus公司；Thermo CL31R型离心机购自美国 Thermo 公司；Multiskan Spectrum 全波长酶标仪购自美国Thermo Scientific 公司；Western印迹电泳仪购自美国Bio-Rad公司；Fluor Chem Q蛋白印迹成像和定量分析系统购自美国Alpha公司。

1.3CHF大鼠模型的制备 随机选择10只大鼠作为正常对照组，其余40只大鼠制备CHF模型。其方法如下：每只大鼠每周腹腔注射盐酸阿霉素注射液4 mg/kg连续6 w，以10%水合氯醛(4.5 ml/kg)进行麻醉，经彩色多普勒超声进行左室射血分数(LVEF)检测，以LVEF≤ 60%判定为造模成功。正常对照组腹腔注射同体积生理盐水，其他操作相同。40只造模成功的大鼠进行后续实验。

1.4分组及给药 将40只造模成功的大鼠随机分为模型对照组、EETs小剂量组、EETs中剂量组和EETs大剂量组各10只。EETs小、中、大剂量组分别每日腹腔注射EETs 10、20、40 μg/kg。正常对照组和模型对照组分别每日腹腔注射同体积生理盐水。各组均连续给药4 w。

1.5观察指标 治疗4 w时检测各组心功能、心脏质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI)、血清IL-6和TNF-α、心肌细胞凋亡指数(AI)及PI3K/AKT信号通路相关蛋白。

1.5.1各组心功能测定 各组末次给药2 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4.5 ml/kg)进行麻醉后仰卧固定，胸前区剃毛，涂抹超声耦合剂后进行测量，取3个心动周期计算平均值。测量参数包括左室舒张期内径(LVIDd)、左室收缩期内径(LVIDs)，计算左室舒张末期容量(LVEDV)和左室收缩末期容量(LVESV)、缩短分数(FS)和LVEF。

1.5.2各组心脏指标(HMI和LVMI)检测 各组大鼠处死后立即取出心脏，采用4℃的生理盐水冲洗心脏残血，用滤纸吸干水分，电子天平分别称取全心质量(THW)、左心室实际质量(LVW)，计算HMI及LVMI，HMI=THW/BW，LVMI=LVW/BW。

1.5.3各组血清IL-6 和TNF-α测定 各组末次给药心功能测定后腹腔静脉采血约1 ml，室温下静止至血液完全凝固后离心(3 000 r/min×10 min)，取上清液采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血清中 IL-6和TNF-α，测定时严格按照试剂盒说明书上所提供的方法及步骤操作。

1.5.4各组心肌细胞凋亡指数测定 剪取各组大鼠左心室的1/2组织，置于4%多聚甲醛溶液固定，经全自动脱水机脱水14 h，常规石蜡包埋，石蜡切片厚5 μm，常规脱蜡，用 0.3%过氧化氢溶液封闭30 min，再用20 mg/L 蛋白酶K消化心肌膜蛋白及核蛋白后，加入TUNEL反应液，37 ℃孵育60 min；加入荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)标记抗体，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片后用显微镜观察。细胞凋亡判定标准：正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色。每只大鼠观察3 张切片，每张切片随机观察5个高倍视野(×400)，每个视野计算凋亡细胞数和细胞总数，计算AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%，取其平均值。

1.5.5各组心肌细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白测定 剪取各组左心室的剩余1/2组织，通过液氮研磨组织分离单细胞，后离心收集细胞，加入RIPA裂解液对细胞进行裂解，于4℃离心(12 000 r/min×10 min)，分离得可溶性蛋白，用BCA法进行蛋白定量，于-20℃保存。进行测量前先将蛋白室温下解冻，100℃变性10 min。取10 μl上样，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶加载等量的蛋白溶液进行电泳，然后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜转印。用5%脱脂奶粉(磷酸化抗体用4% BCA)封闭2 h，分别加入PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin一抗，4℃下孵育过夜。含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗膜3次，加入IgG-HRP，室温避光孵育1 h，PBST洗膜3次。加 ECL 液曝光、显影、定影。 用扫描仪扫描曝光胶片，用 Image J软件分析条带灰度值。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、配对t检验。

2 结 果

2.1各组治疗后心功能指标比较 模型对照组LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均较正常对照组显著升高(P<0.05)，而FS和LVEF均较正常对照组显著降低(P<0.05)。EETs小剂量组和模型对照组LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV、FS和LVEF差异均无统计学意义(P>0.05)；EETs中剂量组LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均较模型对照组和EETs小剂量组显著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均较模型对照组和EETs小剂量组显著升高(P<0.05)；EETs大剂量组LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均较模型对照组、EETs小、中剂量组显著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均较模型对照组、EETs小、中剂量组显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组治疗后心脏指标(HMI和LVMI)、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比较 模型对照组HMI、LVMI、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均较正常对照组显著升高(均P<0.05)。EETs小剂量组和模型对照组HMI、LVMI、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平差异均无统计学意义(均P>0.05)；EETs中剂量组HMI、LVMI、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均较模型对照组和EETs小剂量组显著降低(均P<0.05)；EETs大剂量组HMI、LVMI、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均较模型对照组、EETs小、中剂量组显著降低(均P<0.05)。见表2。

表1 各组治疗后心功能指标比较

表2 各组治疗后心脏指标、心肌细胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比较

2.3各组治疗后心肌细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白比较 模型对照组心肌细胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白表达均较正常对照组显著升高(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达均较正常对照组显著降低(均P<0.05)。EETs小剂量组和模型对照组PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达差异均无统计学意义(均P>0.05)；EETs中剂量组心肌细胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均较模型对照组和EETs小剂量组显著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达均较模型对照组和EETs小剂量组显著升高(均P<0.05)；EETs大剂量组心肌细胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均较模型对照组、EETs小、中剂量组显著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达均较模型对照组、EETs小、中剂量组显著升高(均P<0.05)。见表3。

表3 各组治疗后PI3K/AKT信号通路相关蛋白比较

3 讨 论

CHF时由于心脏的损害或超负荷而导致的心脏工作效率降低，直接的表现就是心脏功能发生障碍。随着人口老龄化和生活方式的改变，CHF患病人数不断增加，据估算目前全球有超过3 800万例心衰患者〔5〕。因为CHF需要长期治疗，并且病情反复，因此产生巨额的医疗费用，成为日益严重的全球性公共卫生问题。EETs是花生四烯酸经细胞色素 P450 表氧化酶的代谢产物，在炎症、心血管功能和血管生成方面发挥着重要作用。EETs在脉管系统通过抑制核转录因子(NF)-κB的激活具有明显的抗炎作用〔6〕。在心血管系统EETs可松弛血管平滑肌细胞，通过激活钙激活K+通道提供心肌保护，还可增加内皮型一氧化氮合成酶的表达和活性从而降低动脉血压〔7〕。EETs通过环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶(PK)A介导的信号通路增加环氧酶-2的表达促进血管生成〔8〕。EETs通过PI3K/AKT信号的激活和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)脱磷酸作用等机制抑制细胞凋亡〔9〕。本研究说明EETs可改善老年CHF大鼠的心功能。HMI和LVMI是分别是左心室肿瘤与心脏质量与体质量的比值，间接反映心脏的左心室功能，而EETs可剂量依赖性降低CHF大鼠HMI和LVMI。

细胞凋亡是一种基因程序化的、活跃的细胞自杀过程，在体内平衡和清除不需要的细胞方面起着至关重要的作用。CHF发病机制尚不明确，而心肌细胞凋亡在CHF 的发生、发展中起着重要作用，会导致心肌收缩功能下降，使 CHF发生进行性恶化〔10，11〕。因此，阻断心肌细胞凋亡可降低CHF发病率，延缓CHF发展，改善心脏各项功能〔12〕。本研究结果说明EETs可抑制CHF大鼠心肌细胞凋亡。

心肌细胞对缺血、缺氧非常敏感，在缺血或缺氧的情况下，炎性因子增多、脂质过氧化水平增加、细胞膜的稳定性及完整性被破坏，导致心肌细胞凋亡〔13〕。IL-6和TNF-α是由单核-巨噬细胞分泌的炎性细胞因子，是参与HF病理过程的细胞因子〔14〕。IL-6 主要由单核细胞和血管内皮细胞产生，可直接或者间接参与炎性细胞的活化，参与左心室重构和心肌纤维化过程从而使其功能失调，加重HF过程中心肌缺血缺氧等炎性损伤反应〔15〕。TNF-α 为抗肿瘤活性细胞因子，当患者出现HF时，其血流动力学异常，左心室舒张末期压力升高，导致心肌细胞受到牵张刺激而产生TNF-α〔16〕。TNF-α可通过负性肌力作用，诱导心室重构，并且对部分原癌基因有激活作用而促发心肌细胞凋亡。本研究结果说明EETs可能通过降低CHF大鼠血清IL-6和TNF-α水平而降低机体炎症反应，从而抑制心肌细胞凋亡。

细胞凋亡途径包括死亡受体途径、线粒体途径以及内质网途径等，PI3K/AKT信号通路被认为是细胞内最重要的生存通路〔17〕，在促进细胞增殖和抗凋亡中发挥重要作用，并且与CHF的发生和发展密切相关〔18〕。PI3K作为该信号通路的起始因子，各种生长因子作用于膜受体而使PI3K激活而产生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3与AKT结合，使 AKT 从细胞质转移到细胞膜上，使AKT磷酸化而被活化〔19〕。过度活化的AKT可直接磷酸化前凋亡基因Bax，激活抗凋亡蛋白Bcl-2，而Bax表达的增加可使线粒体膜对细胞色素 C 的通透性增加，由线粒体进入胞质的细胞色素 C 能够启动 Caspase级联反应并最终激活 Caspase-3执行细胞凋亡过程〔20〕。本研究结果说明EETs可通过调节PI3K/AKT信号通路蛋白的表达而抑制CHF大鼠心肌细胞的凋亡。

综上，EETs对老年CHF大鼠心功能具有改善作用，其作用可能与其抑制心肌细胞凋亡、降低机体炎症反应、调节PI3K/ AKT 信号通路蛋白的表达有关。