联氨基姜黄素对大鼠肝癌的防护作用及其机制

赵冀安 崔丽敏 马艳荣 董梁 聂文佳 刘文聪 刘维丽

(1河北医科大学第一医院普通外科，河北 石家庄 050013；2定州市人民医院肿瘤内科；河北医科大学第一医院 3急诊科；4医务处；5超声科；6肝胆外科)

肝癌是人类最主要的恶性肿瘤之一〔1〕。由于诊断和治疗技术的进步，在早期发现肝癌时，可以通过手术切除，射频消融(RFA)和经导管动脉化疗栓塞(TACE)等进行治疗。然而，肝癌的频繁复发往往会阻碍治疗〔2〕，因为剩余的肝脏仍有致癌的可能〔3〕。通过回顾性研究发现常用的化疗(全身化疗、介入栓塞化疗等)对肝癌患者的总体疗效不佳，并不能提高患者生存率〔4〕。姜黄素(CUR)是姜黄的有效成分，在临床试验中对肝癌、结肠癌、乳腺癌等癌症有很强的抗肿瘤作用〔5,6〕。尽管CUR具有显著的无毒性和良好的抗癌活性，但有研究表明，由于其在生理条件下的不稳定性和生物利用度较低，限制了其在抗癌治疗中的应用〔7,8〕。为了保留CUR良好的药用特性和安全性，同时提高其药效，合成了一种CUR吡唑类似物，即联氨基CUR(HZC)，并应用于多种肿瘤细胞。Rathore等〔9〕通过一种有效的高效液相色谱法(HPLC)，同时测定肠灌注液中的HZC和酚红的不同pH值，发现HZC具有良好的肠道通透性。既往研究证实HZC对于多种癌细胞具有细胞毒性，尤其是HepG2细胞，在所有CUR类似物中，其半数有效量(ED50)值最低〔10〕。Wang等〔11〕研究发现，HZC能有效抑制信号转导和转录活化因子(STAT)3磷酸化程度，降低STAT3下游相关基因的表达，可抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡。DEN已经确定是大鼠肝癌发生的强力药物，在该致癌因子的作用下，通过自身细胞的突变、转化和增殖形成的大鼠肝癌与人肝癌的发生过程相似〔12〕。SD大鼠与人肝癌的相似性已被广泛接受，使其成为肝癌研究的理想模型〔13〕。本文探讨HZC对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌发生和发展的影响，并探究其发生机制。

1 材料与方法

1.1材料 由河北医科大学动物中心提供4 w龄雄性SD大鼠(体重100～110 g)80只。大鼠在恒温(23℃)和恒湿(55%)的12 h光/暗循环的通风室中，使其适应动物房的条件，并在24 w的整个实验期间，喂饲市售颗粒大鼠饲料和水。DEN、兔抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体购自美国Sigma公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBL)试剂盒均购自罗氏公司。

1.2动物分组及给药方法 根据需要将大鼠随机分为：正常对照组〔腹腔注射生理盐水(80 mg/kg)〕、药物对照组〔腹腔注射HZC(80 mg/kg)〕、模型组〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)〕、干预组〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)和HZC(80 mg/kg)〕。以上4组均给药2次/w，12 w后停药。待24 w实验结束。

1.3观察与方法 实验持续24 w，每周末记录体重，实验结束时按照动物伦理准则对所有存活的大鼠进行麻醉并处死。处死前通过心脏穿刺从所有组中采集血样。将血样以3 000 r/min离心3 min，然后分离血清并保持在-20℃，直到用于生化分析。采用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、ALP、GGT、TBL水平。测量大鼠体重和肝脏重量，并计算肝脏指数(肝重/体重×100%)统计肿瘤数量。切取各组肝脏标本。病理学观察：肉眼观察肝脏大体形态,结节大小。鉴于大鼠肝癌多为分散的癌结节，致使计数肿瘤容易出现纰漏。根据相关文献的统计方法，本文将肿物直径大于6 mm的结节认定为肝癌〔12〕。剪取的肝组织用甲醛溶液固定后脱水，56℃石蜡包埋，制备常规切片，进行苏木素-伊红(HE)染色。肝癌的诊断和分级是根据细胞块切片上的形态学发现确定的。增殖细胞核抗原(PCNA)定位于细胞核，阳性呈棕黄色，颗粒状或弥漫性分布。表达强度取决于染色强度(0：阴性；1：弱；2：中；3：强)和阳性细胞百分比(0：0%阳性细胞；1：≤25%阳性细胞；2：26%～50%阳性细胞；3：>50%阳性细胞)。两数相加，最高分数为6分。评分>2分表示标志物的免疫组化认定为阳性。

1.4统计学分析 采用SPSS13.0软件进行χ2检验、方差分析或秩和检验。

2 结 果

2.1各组一般情况比较 正常对照组和药物对照组大鼠体重增长较快，无死亡。随着实验进行，模型组、干预组大鼠饮水和进食开始减少，精神萎靡，毛发干燥，体重增加缓慢且小于正常对照组和药物对照组，但干预组上述症状较模型组轻。实验结束，两个对照组均无死亡。模型组死亡12只，干预组死亡2只，经病理确诊为肝癌。正常对照组、药物对照组均未发生肝癌。模型组和干预组肝癌发病率分别为100.0%和20.0%。模型组平均癌结节数目〔(17.17±1.08)个〕较干预组〔(11.83±3.90)个〕明显增多(P<0.05)。两个对照组及二者与干预组体重、增重、肝重和肝脏指数均无显著差异(均P>0.05)。与两个对照组相比，模型组体重、增重明显降低，肝重和肝脏指数明显增高(P<0.05)。与模型组相比，干预组体重、增重明显升高，肝重、肝脏指数明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组体重、增重、肝重及肝脏比较

2.2各组形态学改变 两个对照组肝脏表面正常，边缘锐利，色泽红润，没有出现增生结节。模型组边缘不整齐，色泽灰白暗淡，可见表面出现大小不等的灰白色癌结节，质地较硬，结节切面有坏死及出血。干预组肝脏也可见白色癌结节，但与模型组相比，癌结节数量明显减少，且结节直径较小，见图1。

图1 各组肝脏形态改变

2.3各组组织病理学改变 正常对照组肝小叶结构完整，细胞无变性坏死，细胞核清晰，肝索规整，且围绕中央静脉呈放射状排列；药物对照组显示出中央静脉和肝血窦轻到中度充血；模型组肝小叶结构严重紊乱，细胞变性，结构消失，细胞核分裂及胞质内分泌颗粒增多，有大小不等的再生结节；干预组同模型组比较，肝小叶结构紊乱和肝细胞变性程度较模型组明显减轻，肝癌细胞排列相对有序，部分癌灶呈现片状坏死，见图2。

2.4各组免疫组化结果 正常对照组和药物对照组肝组织中几乎没有出现PCNA阳性细胞；模型组PCNA蛋白阳性率为70.0%，核深染，提示细胞分裂和增殖旺盛；干预组PCNA蛋白阳性率(13.3%)，与两个对照组(0.0%、0.0%)比较显著上升，但较模型组显著下降(P<0.05)，见图3。

2.5各组肝功能检测 模型组和干预组的ALT、AST、ALP、GGT、TBL指标明显高于两个对照组(P<0.05)。干预组的各项肝功能指标较模型组明显降低(P<0.05)。两个对照组肝功能指差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

图2 各组肝脏组织HE染色(×400)

表2 各组ALT、AST、ALP、GGT和TBL水平比较

3 讨 论

肝脏是大多数化学物质、药物和致癌物质代谢的主要器官〔14〕。有研究报道，给予DEN的大鼠食物摄取减少和随后的体重增重减少可能由于骨骼肌和脂肪组织的丢失，甚至蛋白质消耗引起的〔15〕。有实验报道同对照组相比，给予DEN的大鼠体重显著减少，而肝脏重量会显著增加是由于肝脏癌结节〔16〕，与本研究结果一致。

PCNA是一种细胞增殖活性标志物，可用来反映肿瘤细胞核恶性程度，分化越差指标越高〔17〕。PCNA表达增强提示肝组织增生异常。本研究结果提示DEN可明显诱导肝癌的发生发展，而HZC对DEN诱导的大鼠肝癌模型的发生具有防护作用。

DEN导致的肝脏损伤一般会影响肝细胞功能，肝细胞受损使血清酶释放入血而出现升高改变〔18〕。ALT、AST、ALP、GGT和TBL是反映肝功能损害的敏感指标〔19〕。ALT反映肝细胞损伤最为敏感，即使轻微肝功能损伤，数值也会抬高，而且通常伴随AST升高〔20〕。ALP与管状区的脂质膜密切相关，不管是肝内还是肝外的损害都会导致ALP活性升高〔21〕。GGT是一种膜结合酶，一般位于胆管内上皮细胞和肝细胞滑面内质网中，是肝胆疾病的敏感指标之一。GGT在血清中增高可能由于这种酶从细胞膜中释放至血液循环中，提示致癌物导致细胞膜损害〔22〕。当发生肝癌时，大鼠血清中GGT显著升高是因为该酶从质膜释放到循环系统中，表明由于致癌作用导致细胞膜受损。TBL反映肝细胞损害程度和预后，其增高可能是由于致癌剂的毒性作用损害了肝细胞和窦内皮细胞，致使中央静脉周围的网状结构塌陷产生出血而形成的〔23〕。这与本研究一致。通过使用HZC治疗使这些酶活性较模型组降低，表明HZC保护了细胞膜的完整性，从而降低酶泄漏。提示HZC通过降低ALT、AST、ALP、GGT和TBL活性对肝脏有保护作用。

环氧化酶(COX)-2是COX的一种主要类型，与肝硬化、肝癌的发生发展关系密切，其在肝硬化、肝癌患者肝组织中的表达均高于正常肝组织〔24〕。COX-2被证明通过免疫反应抑制、凋亡抑制、血管生成调节和肿瘤细胞侵袭来影响致癌作用，在癌症发生发展过程中起到关键作用〔25〕。研究发现肿瘤组织COX-2过度表达的患者预后较差〔26〕。研究表明，在许多肿瘤中COX-2过度表达可抑制肿瘤细胞凋亡，而COX-2抑制剂可诱导肿瘤细胞发生凋亡。COX-2是预防和治疗炎症性疾病和癌症的重要靶基因。COX-2启动子区域包括2个核转录因子(NF)-κB结合位点，CUR通过干扰NF-κB激活抑制COX-2表达，从而预防癌症的发生〔27〕。Selvam等〔28〕设计了一系列的CUR衍生物，发现吡唑类衍生物HZC具有对COX-2的抑制、抗氧化和抗炎活性，该研究结果表明，HZC较CUR相比，COX-2的选择性显著增强，并具有明显的抗炎活性，吡唑环取代CUR的β-二酮片段可显著提高COX-2的选择性。原因是HZC含有2个甲氧基，其抗COX-2活性能力高于CUR。本研究认为HZC作用的分子机制可能是通过抑制NF-κB通路及减少COX-2中NF-κB调控基因的表达来实现的。提示HZC通过抑制COX-2的表达来干扰NF-κB的活性，因此具有较好的抗肿瘤活性。

综上，HZC降低了DEN对大鼠肝脏的毒性，从而降低了DEN的发生率、肿瘤数量、肝脏重量、肝脏指数、肝脏标志酶，增加了生存率和体重。证实HZC对DEN诱导的SD大鼠肝癌具有防护作用，但其作用机制仍需进一步探究。