季节对黑猩猩肠道菌群的影响

汪丽芬，俞红燕，楼 毅，张亚兰，顾江萍

（杭州动物园，浙江杭州 310008）

肠道菌群是生存在机体肠道中的微生物群，种类繁多，数量庞大，能不断进行自我调整并能使菌群保持动态平衡，与机体生理活动、健康状况密切相关。国内有用高通量测序法对川金丝猴、大熊猫肠道菌群的研究[1～2]。黑猩猩与人同属人科，是现存与人类血缘最近的高级灵长类动物，尚未有对黑猩猩肠道菌群的季节性变化研究。本试验以杭州动物园6只健康成年黑猩猩为研究对象，采集一年四季24个粪样，通过Illumina MiSeq平台对粪便细菌16S rDNA的V3～V4区进行测序，对黑猩猩肠道菌群的季节性变化进行分析，希望能了解黑猩猩肠道菌群的季节性情况，为一年四季中动物的肠道健康状况提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

浙江省杭州动物园（E120°12′，N30°16′）的6只黑猩猩，编号分别为1～6：明明（♀，1998.3）、老大（♀，2006.3）、老三（♂，2009.8）、老四（♀，2009.9）、老五（♂，2010.9）、老六（♀，2010.1），身体健康状况良好。分别于春天（Spr）、夏天（Sum）、秋天（Fal）、冬天（Win）收集4组24个粪样。

1.2 样品处理

粪样采集前一天晚上需将采样的黑猩猩单笼饲养，于早上08:00取样，挑选较新鲜的粪便，选取粪便中间未被污染的部分于已消毒的采样管中，立即于-40℃冰箱保存。所有粪样在干冰冷藏条件下寄送到上海派森诺生物科技股份有限公司。

1.3 生物信息学数据分析

委托上海派森诺生物科技股份有限公司对样品进行前处理、Illumina Miseq高通量测序及数据分析，测序片段为16S rDNA V3～V4可变区。主要利用FLASH软件[3]（v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）、QIIME软 件[4]（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）对测序序列进行处理、统计，并对稀疏曲线、OTU、Alpha多样性、组间分类学差异和聚类情况进行分析。多样性指数采用SPSS进行单因素方差分析，数据用（±s）表示。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 4个季节黑猩猩样本肠道菌群的OTU分析

4个季节黑猩猩样本肠道菌群共有OTU 1593，春天组占35%，夏天组占35%，秋天组占40%，冬天组占38%（见图1）。

2.2 4个季节黑猩猩样本肠道菌群Alpha多样性分析

4个季节黑猩猩样本肠道菌群多样性指数（Chao1、Ace、 Simpson、Shannon）见表1，各组间无显著差异。

表1 4个季节黑猩猩样本肠道菌群多样性指数表

2.3 4个季节黑猩猩样本肠道菌群组间分类学差异分析

季节组间存在显著差异的菌门为厚壁菌门、变形菌门。夏天组厚壁菌门丰度显著高于其它3组。变形菌门冬天组丰度最高，显著高于夏天组。夏天组WPS-2门显著低于秋天组、冬天组（见图2）。

组间存在显著差异的菌门：春天组中，布雷德菌属显著高于冬季组，链型杆菌属和脱盐杆菌属显著高于秋天组；夏天组中，贪铜菌属显著高于其它3个季节，RFN20菌属显著高于春天组；秋天组中，普雷沃氏菌属显著高于夏天组，布劳特菌属和多尔氏菌属显著高于冬天组、多尔氏菌属显著高于夏天、冬天组；冬天组中，厌氧弧菌属显著高于春、夏天组，拟杆菌属和琥珀酸弧菌属显著高于夏天、秋天组，脱硫弧菌属显著高于春天组，小类杆菌属和毛形杆菌属显著高于夏天组，Sphaerochaeta菌属显著高于其它各组（见图3）。

2.4 4个季节黑猩猩样本肠道菌群的聚类分析

Win1和Fal1相似度最高，其次为Spr6和Sum6，表现出个体的特异性。除1、6号样本各季节大部分样品聚在一起，表明各季节样本间有一定的相似性，季节可能会对黑猩猩的肠道菌群产生影响（见图4）。

3 分析与讨论

4个季节黑猩猩样本肠道菌群中3种菌门、18种菌属有显著差异，春天组多样性指数最高，各样本菌群聚类分析中除1、6号样本各组样品相似性较高，季节可能会对黑猩猩的肠道菌群产生影响。大熊猫肠道菌群多样性组成的主成份分析显示环境温度是影响着大熊猫肠道菌群的两大因子之一[5]。

贪铜菌属夏天组丰度显著高于其它3个季节，Sphaerochaeta菌属冬天组丰度显著高于其它各组，粪杆菌属夏天组丰度显著低于其它3个季节，这3种菌可能与温度相关。金毛扭角羚春季和冬季肠道菌群有5个菌属存在差异，与本试验菌属均不同[6]。Sphaerochaeta是一种化能异养厌氧茵、革兰氏阴性菌，发酵糖类、有机酸产生乙酸、甲酸、甲醇[7]。该细菌利用乳酸转运系统将环境中的乳酸摄入体内，转化为-D-葡萄糖，进入糖酵解过程，最终生成乙酸、H2和C02[8]。但由于黑猩猩样本量的限制，特别是不能排除性别的影响，因而试验结果还需验证与完善。