不同枳椇原料和酵母对枳椇果酒品质的影响

黄萧天，魏丕伟，梅梦苧，明 月，廖高鹏，王凌云

（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000）

枳椇（Hovenia acerbaLindl） 为鼠李科枳椇属植物（Rhamnacea genus）[1]，始载于《唐本草》，别名拐枣、甜半夜、木蜜、万寿果、金钩子等[2]；在《唐本草》 《本草纲目》 《老老恒言》 和《滇南本草》等医药著中均有记载，兼具食用与药用价值；其果梗肉质肥大、扭曲弯曲，味甘甜如枣[3]；成熟后的枳椇果梗具有浓郁的甜味和独特的枳椇香。中医认为，其有清热利尿、生津止渴、解酒毒、润燥、凉血等功效[4]。通过对枳椇子化学成分进行研究，发现其含有枳椇皂苷[5]、生物碱-黑麦草碱[6-7]、多种活性黄酮类物质[8-10]等多种成分，在保肝和抗肝纤维化[11-12]、解酒利尿[11，13]、抑制肿瘤细胞生长[14]、抗疲劳[15]、治疗肾结石[16]、增强综合体能、保护神经、抗氧化等方面发挥药理作用。

枳椇具有丰富的化学成分与多种药理作用，用于酿造枳椇果酒具有很大的药用价值与市场前景。介于枳椇分布广泛、品种繁多，通过多种枳椇与多种酵母相互搭配，筛选最佳的枳椇原料与酵母，同时用抗氧化性试验加以验证，为酿造出一款优良的枳椇果酒提供实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母：3 号酵母（法国LAFFORT 酿酒酵母W33）、5 号酵母（法国LAFFORT 酿酒酵母FX10）、8 号酵母（法国LALLEMAND 葡萄酒酵母RC212）、9 号酵母（法国LALLEMAND 酿酒酵母71B），这4 株为葡萄酒酵母；A1 酵母、A2 酵母、A3 酵母、A4 酵母、B1 酵母、B2 酵母，这6 株为小曲曲药分化而得；景芝B 酵母、丰谷9-1 酵母、丰谷9-2 酵母、丰谷10-1 酵母、丰谷10-2 酵母、丰谷11-1 酵母、丰谷12-1 酵母、丰谷12-2 酵母，这8 株为大曲曲药分化而得；枳椇：贵州铜仁、广州清远、陕西宝鸡、湖北襄阳、四川攀枝花、福建龙岩、湖北英山，产自上述7 个产地的枳椇；其余试剂，均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

TSQ8131006 型气质联用仪，Thermo Scientific 公司产品；QYC-2102 型全温空气摇床，上海福玛实验设备有限公司产品；UV-5500PC 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；SHP-250E 型生化培养箱，上海培因实验仪器有限公司产品；PAL-1 型手持糖量计折射仪，成都格纳丝商贸有限公司产品；RJ-TDL-50A 型低速台式大容量离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司产品；KQ-700DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.3 工艺流程

取枳椇粉→纯水混匀→加SO2抑制杂菌→调整发酵液pH 值5.0，糖度20 °Bx→接种酵母→主发酵→振荡摇匀→后发酵→过滤→加SO2结束发酵→灭菌→成品。

1.4 果酒的感官品评标准

品评标准主要依据果酒的国家标准[17]，并参考了果酒评定标准的相关文献[18-19]，得到枳椇果酒的感官评分标准（表1）。邀请有果酒品评经验的学生组成5 人评酒小组，对发酵好的枳椇果酒的外观、香气、口感等特点进行综合感官评分，取平均值作为最终结果。

枳椇果酒的感官评分标准见表1。

表1 枳果酒的感官评分标准

表1 枳果酒的感官评分标准

项目 评 分 标 准 感官评分/分色泽（满分20 分）澄清透明，果酒呈琥珀色，协调悦目澄清透明，果酒呈淡黄色澄清，无杂物，与枳椇果酒色泽不符微混，有杂物，失光2018～1915～17<15香气（满分40 分）果香、酒香浓郁幽雅，香气干净，香甜感好果香、酒香良好，具有枳椇的特有香气果香、酒香一般，但无异香果香、酒香不足或有异味38～4034～3730～33<30口感（满分40 分）酒体丰满、柔和爽口，口感协调，果香味突出酒体较丰满，酸甜适当，纯正无杂酒体较寡淡，略酸或略甜，酸甜不协调，口感欠浓郁酒体寡淡，酸、涩、苦、平淡，有异味38～4034～3730～33<30

1.5 酵母菌种的筛选

将四川攀枝花枳椇搭配18 种不同的酵母进行发酵，期间定时记录不同酵母发酵的产气情况，发酵完成后测定酒精度并进行感官评定。取枳椇粉200 g，加入4 L 纯水，加糖分溶解，用孔径0.15 mm，100 目的标准检验筛过滤掉残渣，向澄清液中加入0.2 g/L二氧化硫，抑制杂菌。调整澄清液pH 值5.0，糖度20 °Bx，混匀后再分装入54 个三角瓶（250 mL），每个倒入200 mL 发酵液，添加酵母后在33 ℃生化培养箱进行发酵。用气球代替三角瓶的棉塞，同时满足发酵前期的有氧呼吸与后期的无氧呼吸，主发酵时期，定时振荡摇匀发酵醪液，并定时排气。后发酵时期，产气明显减少后，用保鲜膜代替气球隔绝氧气。发酵完成后，过滤弃沉淀，加入质量浓度1 g/L的二氧化硫终止发酵。

1.6 枳椇原料的筛选

将7 种枳椇粉配合同一种酵母（试验1.5 选出的最佳酵母） 进行发酵，期间定时记录不同酵母发酵的产气情况，发酵完成后测定酒精度，并进行感官评定，由此挑选出合适的枳椇原料。分别称取7 个产地的枳椇粉84 g 于1000 mL 蓝口瓶中，加入600 mL纯水，振荡摇匀，使枳椇粉质量（g） 与纯水体积（L） 比例为140∶1，后续试验方法同1.5。

1.7 菌种与枳椇的最佳搭配

将试验1.5、试验1.6 挑选出的4 种酵母与4 种产地的枳椇原料进行不同的搭配组合，期间定时记录不同酵母发酵的产气情况，发酵完成后测定酒精度，并进行感官评定，由此挑选出合适的枳椇原料。分别将4 个产地的枳椇粉112 g 于1000 mL 蓝口瓶中，再添加预先配好的2%食用酒精和质量浓度0.1 g/L 的二氧化硫的超纯水800 mL，使枳椇粉质量（g） 与超纯水溶液体积（L） 比例为140∶1，振荡摇匀，在超声功率90 W 下，超声处理30 min，促进枳椇多糖溶出；添加果胶酶0.1 g/L，再45 ℃水浴保温1～2 h，调整澄清液pH 值为5.0，糖度20 °Bx，添加酵母后在26 ℃下进行发酵，后续试验方法同1.5。

1.8 体外抗氧化试验方法

1.8.1 二苯代苦味酰基自由基（DPPH·） 的清除率测定

参照文献[20-22]方法稍作修改，分为空白组、样品组、本底组和调空白；样品组：取酒样2 mL 加入到质量浓度为0.04 mg/mL 的DPPH·溶液2 mL（无水乙醇配制）；空白组以2 mL 超纯水代替样品；本底组以无水乙醇代替DPPH -乙醇溶液。另外，分为3 组加入1 个调控白：取2 mL 超纯水和2 mL 无水乙醇的混合，以上溶液混合均匀，置25 ℃恒温水浴室中30 min，于波长517 nm 处测定吸光度，每组平行3 次，根据公式计算DPPH·清除率；同时配制1 mmol/L 的维C 溶液并测定，作为阳性对照。

式中：As——样本组吸光度；

Ap——本底组吸光度；

Ab——空白组吸光度。

1.8.2 超氧阴离子自由基（O2-·） 清除率测定

参考文献[23-25]方法稍作修改，分为空白组、样品组、本底组和调空白，每组都加入0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液4.5 mL（pH 值8.2）；空白组：加入超纯水1 mL 和3 mmol/L 焦性没食子酸溶液0.3 mL；样品组：分别加入样品1 mL 和焦性没食子酸溶液0.3 mL；本底组：加入酒样1 mL 和10 mmol/L 的HCl溶液0.3 mL。另外，分为3 组加入1 个调控白：则再加入1.3 mL 超纯水；每组均做3 个平行。加试剂后于25 ℃下水浴5 min，立即都加入0.1 mL 8 mol/L 的HCl终止反应，于波长325 nm 处测定吸光度，每组平行3 次，根据公式计算清除率。同时，配制1 mmol/L的维C 溶液并测定，作为阳性对照。

式中：As——样本组吸光度；

Ap——本底组吸光度；

Ab——空白组吸光度。

1.8.3 羟自由基（·OH） 清除率测定

参考文献[26-28]方法稍作修改，分为空白组、对照组、样品组、本底组和调空白；在空白组、对照组和样品组中按顺序加入配制好的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液2.5 mL（pH 值7.4），0.75 mmol/L 邻菲罗啉溶液1.0 mL，0.75 mmol/L 的FeSO4溶液1.0 mL；同时，空白组加入超纯水0.5 mL 和0.01%的H2O2溶液1 mL；对照组加入超纯水1.5 mL；样品组加入样品0.5 mL；本底组加入样品0.5 mL、磷酸盐缓冲液2.5 mL 和超纯水3 mL；另外，外用超纯水3.5 mL 和磷酸盐缓冲液2.5 mL 作为调空白，反应混合物在恒温条件下（37 ℃） 水浴反应1 h 后，于波长510 nm 处测定吸光度，每组平行3 次，根据公式计算清除率。同时，配制浓度为1 mmol/L 的维C 溶液并测定，作为阳性对照。

式中：Db——空白组吸光度；

Dc——对照组的吸光度；

Ds——样品组的吸光度；

Dp——本底组的吸光度。

1.9 理化指标检测

酒精度采用酒精计法[29]，可溶性固形物采用手持糖量计折射仪，pH 值采用pH 计。

1.10 数据统计分析

采用SPSS 25.0 软件进行显著性差异分析，Origin 2018 进行图像绘制及数据处理，Microsoft Excel 2020 软件数据分析。每组试验均重复3 次以上。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的筛选

用于发酵枳椇果酒的18 株酵母中，有用于葡萄酒发酵的4 株酵母：3 号、5 号、8 号、9 号；有从小曲曲药中分离纯化得来的6 株酵母：A1、A2、A3、A4、B1、B2；还有从大曲曲药中分离纯化得来的8 株酵母：景芝B、丰谷9-1、丰谷9-2、丰谷10-1、丰谷10-2、丰谷11-1、丰谷12-1、丰谷12-2。以攀枝花产地的枳椇作为枳椇原料分别进行发酵，其中A1、A2、A3、A4、丰谷9-2、丰谷10-2、丰谷12-1 这7 株酵母的乙醇耐受性最高，能耐受12%的乙醇体积分数。

不同酵母菌所发酵的枳椇果酒的菌膜和澄清度情况见表2。

表2 不同酵母菌所发酵的枳果酒的菌膜和澄清度情况

表2 不同酵母菌所发酵的枳果酒的菌膜和澄清度情况

注：“****”表示澄清，“***”表示较澄清，“**”表示微浑浊，“*”表示浑浊

菌种编号 有无菌膜 澄清度 菌种编号 有无菌膜 澄清度3 号5 号8 号9 号A1 A2 A3 A4 B2无无无无无无无无无*************************丰谷9-2丰谷10-2丰谷12-1丰谷9-1丰谷10-1丰谷11-1丰谷12-2 B1景芝B无无无有有有有有有*************

由表2 可知，丰谷9-1、丰谷10-1、丰谷11-1、丰谷12-2、B1、景芝B，这6 株酵母的酒液表面都长了菌膜，且酒体浑浊，不适合用来发酵枳椇。剩下的12 株酵母：3 号、5 号、8 号、9 号、A1、A2、A3、A4、B2、丰谷9-2、丰谷10-2、丰谷12-1，对其发酵酿制的枳椇酒进行酒精度测定和感官评分。

不同酵母所发酵果酒的酒精度与感官评分折线图见图1。

由图1 可知，菌种编号中3 号、丰谷10-2 酵母酿制的枳椇酒酒精度最高，达到6.23%Vol；其次是5 号、A2，酒精度达到了6.20%Vol；而A3 酵母酿制的枳椇酒酒精度最低，仅有3.83%Vol。从感官评分来看，3 号酵母酿制的枳椇酒感官评分最高为90.60 分，呈深黄色、香气良好、酒体丰满、酸甜协调、口感纯正；其次是5 号酵母酿制的枳椇酒感官评分为90.20 分，呈深黄色、酒香浓郁、酒体丰满、醇厚协调、有发酵风味；A2 酵母酿制的枳椇酒感官评分为88.00 分，呈深黄色、香气良好、酒体较丰满、酸甜较协调、甜味不足；丰谷10-2 酵母酿制的枳椇酒感官评分为87.80 分，深黄色、香气一般、酒体丰满、协调纯正、后味微酸。而B2 酵母酿制的枳椇酒感官评分最低为67.40 分，呈深黄色、香气良好、酒体寡淡、酸涩味明显、甜味不足，同时酒精度只有4.7%Vol。结果表明，用四川攀枝花为原料酿造的枳椇酒普遍含有不同程度的药香味。综合酒精度与感官评分，3、5、A2、丰谷10-2 这4 种枳椇酿造出的枳椇果酒更为优质，并取这4 种枳椇进行后续试验。

图1 不同酵母所发酵果酒的酒精度与感官评分折线图

2.2 枳椇原料的筛选

取贵州铜仁、广州清远、陕西宝鸡、湖北襄阳、四川攀枝花、福建龙岩、湖北英山这7 个产地的枳椇配制成发酵液，都添加试验2.1 筛选出的3 号酵母进行发酵，测定其酒精度并进行感官评分。

不同枳椇原料所发酵果酒的酒精度与感官评分折线图见图2。

图2 不同枳原料所发酵果酒的酒精度与感官评分折线图

由图2 可知，由酒精度来看，贵州铜仁产地的枳椇酿制的枳椇酒酒精度最高为8.23%Vol；其次是广州清远为8.07%Vol，陕西宝鸡为7.23%Vol，湖北襄阳为6.73%Vol，四川攀枝花为6.43%Vol，福建龙岩为5.97%Vol；最低的是湖北英山为5.13%Vol。从感官评分来看，贵州铜仁产地枳椇酿造的枳椇酒感官评分最高为90.00 分，呈深黄色、香气浓郁、略带果香、酒体丰满、口感纯净；其次是攀枝花酿造的枳椇酒感官评分为85.60 分，呈黄色，果香突出，有回甜味。湖北英山酿造的枳椇酒感官评分为85.40 分，呈琥珀色，略带果香，口感纯正。湖北襄阳酿造的枳椇酒感官评分为81.60 分，呈淡黄色，略带烟熏气味，酒体较丰满，协调纯净。而广州清远酿造的枳椇酒感官评分为72.40 分，呈黄色，异香明显，酒体较寡淡，有回苦味。陕西宝鸡酿造的枳椇酒感官评分为73.00 分，呈深黄色，果香浓郁，但酒体较寡淡、酸涩味太重。福建龙岩酿造的枳椇酒感官评分最低，仅有63.00 分，呈深黄色，但异香明显，酒体寡淡，口感差，无愉悦感。综合枳椇酒的酒精度和感官评分，选出4 款较为优质的枳椇原料：产地为四川攀枝花、贵州铜仁、湖北英山和湖北襄阳，并用于下一步试验。

2.3 菌种与枳椇的最佳搭配

将试验2.1 和2.2 筛选出的4 种枳椇与4 种酵母组成16 种不同的搭配方式，湖北英山产地的枳椇与3、5、A2、丰谷10-2 这4 种酵母的搭配编号为1、2、3、4；湖北襄阳与4 种酵母的搭配编号为5、6、7、8；贵州铜仁与4 种酵母的搭配编号为9、10、11、12；四川攀枝花与4 种酵母的搭配编号为13、14、15、16。观察这16 种枳椇酒的产气情况，在发酵的第2 天，枳椇酒普遍开始有明显气体产生；在发酵的第5～7 天，16 款枳椇酒的产气量分别达到最大；在发酵的第8 天，大部分枳椇酒的的产气出现不同程度的降低；在发酵的第10 天，枳椇酒的产气量偏低并趋于稳定。因此，确定枳椇酒的主发酵时间为10 d，后发酵时间为20 d。全部发酵完成后，进行酒精度的测定和感官评定。

不同搭配方式所发酵果酒的酒精度与感官评分情况见表3。

经过前2 次试验的筛选，这一批次的果酒酒精度明显提高，其中编号为9 的枳椇酒酒精度最高为11.83%Vol；其次，编号为9 和12 的枳椇酒的酒精度为11.80%Vol，而编号为14 的枳椇酒酒精度最低为7.73%Vol。由表3 可知，酒精度较高的枳椇酒主要集中在枳椇原料为湖北襄阳和贵州铜仁。

表3 不同搭配方式所发酵果酒的酒精度与感官评分情况

由感官评分可知，3 号酵母与贵州铜仁产地枳椇搭配发酵的枳椇果酒感官评分最高为91.00 分，呈深黄色，澄清度高，香气浓郁，酒体丰满，带有果香。同一枳椇作为原料的情况下，用于产葡萄酒的3 号酵母和5 号酵母发酵的枳椇果酒比产白酒的酵母A2 和丰谷10-2 酵母的枳椇酒整体品质更好。同时，贵州铜仁枳椇原料酿制的枳椇酒酒品质整体较好，部分枳椇酒香气协调，带有果香；湖北英山的枳椇原料酿制的果酒整体感官评分较高，但澄清度稍一般；湖北襄阳的枳椇原料酿制的果酒虽然澄清度较高，但整体带有烟熏气味、酸味重；四川攀枝花枳椇原料酿制的果酒虽然果酒药香明显，普遍有酸涩味，且酒精度偏低；综合酒精度与感官评分，编号9 即贵州铜仁的枳椇与3 号酵母搭配酿成的果酒品质最佳。

2.4 枳椇发酵酒的抗氧化结果

枳椇果酒对3 种自由基的清除能力见图3。

图3 枳果酒对3 种自由基的清除能力

由图3 可知，对铜仁枳椇与3 号酵母搭配的枳椇酒进行体外抗氧化活性试验，DPPH·，及·OH的清除率分别达到了88.03%，93.94%，98.31%。1 mmol/L 维C 对DPPH·，及·OH 的清除率分别达到了91.45%，71.51%，36.33%。枳椇酒对DPPH·自由基的清除率与1 mmol/L 维C 相差不大，但对及·OH 的清除率优于1 mmol/L 维C；同时，在对羟基自由基清除率测定试验中，枳椇果酒是稀释了1 倍后进行的，实际对·OH 的清除率应高于98.31%。综上所述，铜仁枳椇与3 号酵母发酵酿制的枳椇酒整体抗氧化能力良好。

3 结论

将产自四川攀枝花的枳椇作为发酵原料，分别添加18 种酵母菌进行发酵试验，酿制成的枳椇果酒，首先从澄清度及菌膜情况进行了初步筛选，排除了6 种酒体浑浊且酒体表面生长了菌膜的劣质枳椇酒。同时，从剩下的12 款枳椇酒中，以酒精度和感官评分为指标，选择出了3、5、A2、丰谷10-2这4 种更适于酿造枳椇果酒的酵母。常用于葡萄酒发酵的3 号酵母作为发酵菌种，分别以7 种不同产地的枳椇作为发酵原料，酿制成的枳椇果酒以酒精度、感官评分为指标，发现了四川攀枝花、贵州铜仁、湖北英山、湖北襄阳这4 个产地酿造的枳椇果酒，整体酒精度和感官评分都较高。将挑选出的4 种枳椇和4 种酵母相互搭配后进行发酵，发酵完成后，根据酒精度及感官评分，选出编号9 即贵州铜仁的枳椇与3 号酵母为最佳搭配，该果酒品质整体较好，澄清度和感官评分都较高，香气协调、酒体丰满，带有果香。

在体外抗氧化活性试验中，以贵州铜仁产地的枳椇和3 号酵母搭配发酵的枳椇酒对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、超阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH） 的清除率平均分别达到了88.03%，93.94%，98.31%；同时，枳椇酒对DPPH·的清除率与1 mmol/L 维C 相差不大，但对O2-·及·OH 的清除率确优于1 mmol/L 维C，证明此枳椇酒整体抗氧化能力较好。

综上所述，经过18 种酵母菌种和7 种不同产地枳椇相互搭配发酵，最终筛选出贵州铜仁产地的枳椇与3 号酵母发酵的枳椇果酒，整体品质最高且抗氧化活性良好，是一款优质的枳椇果酒，为果酒企业对于枳椇产品的开发提供了基础研究理论。