冬眠对达乌尔黄鼠盲肠菌群的影响

毛敏 杨明 刘新宇

（沈阳师范大学生命科学学院，沈阳 110034）

经过长期的协同进化，肠道菌群成为宿主不可分割的一部分，并与宿主形成互惠共生关系(Leyet al.,2006,2008;Dominguez-Belloet al.,2019)。肠道微生物为宿主健康做出了很多贡献，如将宿主难以消化的食物成分转化为短链脂肪酸，并对宿主提供能量，感应周围环境变化并调控宿主代谢，促进肠道稳态，刺激免疫系统的发展，提供针对病原体的保护等(Van den Abbeeleet al.,2011;Makkiet al.,2018;Rastelliet al.,2019)。作为回报，宿主为肠道微生物种群提供了适宜的生存环境和丰富的营养物质(Bäckhedet al.,2005;Hanning and Diaz-Sanchez,2015)。肠道微生物组成、多样性和功能的变化受地理分布、饮食、益生菌和益生元的使用、抗生素的使用以及环境等因素的影响(Singhet al.,2017;Anwaret al.,2021)。研究发现，饮食干预会改变哺乳动物肠道微生物的组成(Kashyapet al.,2013;Kohlet al.,2014;Rinninellaet al.,2020)。冬眠哺乳动物具有极端饮食变化的特征，这有利于研究进食状态对肠道微生物的影响。在多纹黄鼠(Ictidomys tridecemlineatus)和北极黄鼠(Urocitellus parryii)的研究中发现，冬眠会对肠道菌群的多样性和组成产生影响(Careyet al.,2013;Dill-McFarlandet al.,2014;Stevensonet al.,2014)。但需要与其他冬眠动物的研究结果相结合，以确定多纹黄鼠和北极黄鼠肠道菌群的季节性变化是独有的还是专性冬眠动物共有的现象。

达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)是典型的储脂类冬眠动物，与多纹黄鼠和北极黄鼠同属于松鼠科黄鼠属，活动具有明显的周期性(杨明等，2011)。在夏季和秋季，达乌尔黄鼠体温与恒温动物相近，可以进行持续的觅食等行为活动。在育肥期间，达乌尔黄鼠摄食逐渐增加，体重迅速增长，体内的脂肪大量积累(吕铮等，2014；邢昕等，2015)；育肥完成期后，达乌尔黄鼠的体重、代谢率和体温逐渐下降(管淑君，2010；吕铮等，2014；邢昕等，2015)；冬季入眠后，达乌尔黄鼠处于低代谢状态，体温随环境温度的降低而降低，并接近环境温度，体重也缓慢下降，基本不进食或少进食，主要通过消耗体内脂肪来提供能量(门丽媛等，2015;Xinget al.,2015;Renet al.,2022)；冬眠过后，达乌尔黄鼠的体温和代谢率开始恢复，并开始活动和摄食。结合以上研究，我们假设达乌尔黄鼠冬眠前后体温及能量代谢的巨大生理变化可能会对其肠道菌群的多样性、组成和功能产生重要影响，并推测冬眠期达乌尔黄鼠肠道菌群中偏好膳食纤维的厚壁菌门减少，可以降解宿主聚糖的拟杆菌门增加。为验证上述假设，本研究通过16S rRNA基因高通量测序技术对育肥阶段和冬眠阶段达乌尔黄鼠盲肠菌群的多样性和组成进行比较分析，利用PICRUSt预测不同时期盲肠菌群的功能变化，并通过冗余分析(Redundancy analysis,RDA)分析达乌尔黄鼠的生理特征与盲肠菌群组成和功能之间的关系，从而探究冬眠对达乌尔黄鼠盲肠菌群的影响，并继续分析盲肠菌群组成和功能的季节性变化是否对宿主的生理功能产生间接影响，从而为揭示肠道菌群在冬眠动物生理代谢中的作用提供依据。

1 研究方法

1.1 实验动物

在内蒙古通辽市 (北纬 43°22′12″，东经 122°09′36″)捕捉47只雌性达乌尔黄鼠，带回沈阳师范大学动物房单笼(48 cm×35 cm×20 cm)饲养，用碎刨花做巢材，饲喂标准鼠粮(沈阳前民饲料厂)和饮用水。6—9月，动物房的温度为(23±2)℃，光周期为12L∶12D。9月初开始，当发现达乌尔黄鼠出现蛰眠状态时，将其移至室温(5±2)℃且恒黑的低温房内，笼内放入适量的巢材和棉花，并提供标准鼠粮和饮用水；1月初，将出眠的达乌尔黄鼠移出低温房，并提供活跃季节相同的环境温度和食物。

1.2 样本收集

根据达乌尔黄鼠体重的变化将其分为起始育肥期组(Initial fattening group,IF)、快速育肥期组(Rapid fattening group,RF)以及育肥完成期组(Finished fattening group,FF)，根据动物冬眠的时长分为冬眠早期组(Early hibernation group,EH)、冬眠晚期组(Late hibernation group,LH)以及出眠期组(Arousal group,A)，共6组，FF组的实验动物为7只，其余组为8只。每只动物用电子天平(上表电子仪器厂，SB10001)测量体重，CO2麻醉后断颈处死，在超净工作台中收集6个时期的盲肠内容物置于15 mL灭菌管中，冻存于-80℃冰箱备用。

1.3 16S rRNA基因高通量测序

使用ForeGene粪便基因组DNA提取试剂盒提取样本中的总DNA，用Nano drop检测其纯度，Qubit检测其浓度。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性后，选择合格的样品送胤安国际(辽宁)基因科技股份有限公司测序。

使用MetaVxTMLibrary Preparation kit对样本中16S rDNA的V3、V4区域进行扩增并构建DNA文库，使用的引物为Forward：CCTACGGRRBGCAS CAGKVRVGAAT；Reverse：GGACTACNVGGGT WTCTAATCC。用 HT RNA Pico Sensitivity Reagent Kit试剂盒在Lab Chip Touch 24大分子分析仪上检测文库质量后，使用Illumina MiSeq测序仪进行读长为300 bp的DNA测序。

1.4 生物信息学分析和统计学分析

原始序列的数据使用QIIME1.7.0处理。使用Flash软件将双端的序列合并，对原始数据进行fastqc质控，删除低质量的序列并切除引物和接头序列，使用mothur软件的denovo方法去除嵌合体序 列 (Schlosset al.,2009;Magoč and Salzberg,2011)。优化的序列用QIIME1中de novo OTU聚类的方法根据序列97%的相似性聚类生成操作分类单元(OTU)，并通过Silva数据库进行物种注释(Caporasoet al.,2010)。为了能够比较不同测序量的样本，用等量重抽样和CSS方法对每个样本的序列数量标准化处理(Paulsonet al.,2013)。根据标准化的OTU，使用QIIME软件对样品进行Alpha和Beta多样性分析。Alpha多样性指数包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson等指数，其中Chao1和ACE是计算菌群丰富度(Community richness)的指数，两者值越大，表明样品的丰富度越高；Shannon指数和Simpson指数用来估算样品中菌群多样性(Community diversity)，Shannon指数越高，说明样品中的菌群多样性越高，Simpson指数越大，表示样品中的菌群多样性越低(Shannon,1948;Simpson,1949;Chao,1984;Chaoet al.,1993)。在Alpha多样性指数的差异显著性分析中，符合正态分布且方差齐性时用单因素方差分析，非正态分布或方差不齐时使用K-W轶和检验，数据结果用mean±SE表示，weighted UniFrac和unweighted UniFrac距离矩阵的主坐标分析(PCoA)通过ANOSIM分析和非参数多元方差分析检验(Lozupone and Knight,2005;Lozuponeet al.,2011)。采用SPSS 26.0软件中的单因素方差分析或K-W轶和检验分析门、科和属水平中优势菌群的差异显著性。使用PICRUSt软件预测盲肠菌群的功能(Langilleet al.,2013)，结合KEGG数据库对基因功能注释，并利用LefSe分析对KEGG功能预测结果中的3个层级功能进行差异统计，用线性判别分析(LDA)条形图进行可视化展示，当LDA＞2，P＜0.05时有显著性差异(Segataet al.,2011)。使用R version 3.6.3软件的vegan包分别对达乌尔黄鼠不同时期的生理特征与其盲肠菌群组成和功能的相关性进行RDA分析，我们之前已对同一批动物的生理指标进行检测，详见Ren等(2022)。

2 结果

2.1 OTU总数和Alpha多样性分析

对47只达乌尔黄鼠盲肠内容物中的16S rRNA基因进行测序并经过质量处理，共检测到3 308 681个序列，平均每个样品有551 446个序列。这些序列根据97%的相似性聚类生成1 741个OTU总数，其中A组的OTU总数最高，EH组的OTU总数最低，但各组之间的OTU总数差异不显著(P=0.068)(表1)。随机抽取样品中一定数量的序列绘制稀释曲线(图1)显示，样品的曲线都趋于平缓，表明所有样品的测序数量合理，能够涵盖样品中绝大多数的微生物物种信息。

表1 不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的Alpha多样性指数表Table 1 Index table of Alpha diversity of cecal microbiota of Daurian ground squirrel in different periods

图1 不同时期达乌尔黄鼠观察到的OTU数的稀释曲线.图中的每一个样本用不同的曲线代表，不同的颜色表示不同的分组；随着样本序列数的增加，OTU的数量也在增加；最终，曲线开始趋于平缓，说明所有样品的测序数量合理，能够涵盖样品中绝大多数微生物物种信息.IF：起始育肥期组；RF：快速育肥期组；FF：育肥完成期组；EH：冬眠早期组；LH：冬眠晚期组；A：出眠期组；图2～5同Fig.1 The rarefaction curves of observed species of Daurian ground squirrel in different periods.Each sample in the figure is represented by a different curve,and different colors indicate different groupings.With the increase of sequence per sample,the observed species also increases.Finally,the curve began to plateau,indicating that the sequencing quantity of all samples was reasonable,and could cover the information of the vast majority of microbial species in the samples.IF:Initial fattening group;RF:Rapid fattening group;FF:Finished fattening group;EH:Early hibernation group;LH:Late hibernation group;A:Arousal group;the same to figure 2-5

通过Alpha多样性分析，能反映不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的丰富度和均匀度。根据Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数(表1)，发现不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的Alpha多样性不同。其中，Chao1指数和ACE指数在A组与IF、RF和EH组之间存在显著差异(Chao1：P=0.005；ACE：P=0.005)，说明A组的菌群丰富度显著高于IF、RF和EH组。Shannon指数在6组样品中无显著差异(P=0.075)。Simpson指数在RF和FF组间存在显著差异(P=0.017)，且FF组的菌群多样性显著低于RF组。

2.2 Beta多样性分析

根据距离矩阵显示达乌尔黄鼠各组的样品在组内较分散，但通过ANOSIM分析发现，各组样品的组间差异显著大于组内差异(加权：R=0.37，P=0.001；非加权：R=0.56，P=0.001)。将每只达乌尔黄鼠盲肠菌群基于加权和非加权的UniFrac距离矩阵的主坐标分析，发现均显示出了明显的季节性聚类(图2A，B)。育肥期和冬眠期的盲肠菌群有明显的分离，其中IF、RF和FF组的菌群聚集在一起，而EH和LH组的菌群聚集在一起，A组的菌群比较分散，介于育肥期和冬眠期之间(加权：R2=0.27，P=0.001；非加权：R2=0.29，P=0.001)。结果表明IF、RF和FF组的盲肠菌群结构更相似，而与EH和LH组的盲肠菌群结构相似性低。

图2 不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群基于加权(A)和非加权(B)UniFrac距离矩阵的主坐标分析(PCoA).横坐标和纵坐标表示选定的两个主坐标轴；百分比表示主坐标轴对样本组成差异的解释度；刻度是相对距离，无实际意义；不同颜色的置信椭圆代表不同的分组；不同颜色或形状的点代表不同分组的样本，两样本的点越接近，表明两样本盲肠菌群结构组成越相似Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of the weighted(A)and unweighted(B)UniFrac distance matrix compared with the cecal microbiota of Daurian ground squirrel in different periods.The abscissa and ordinate represent are the two selected main axes,and the percentage represents the contribution of the main axis to explain the difference in sample composition.The scale is relative distance has no practical significance.Confidence ellipses of different colors represent different groups and the dots of different colors and shapes represent samples of different groups.The closer the points of the two samples are,the more similar the cecal microbiota of the two samples is proved

2.3 盲肠菌群组成

达乌尔黄鼠盲肠内的菌群有10门15纲20目42科147属。根据注释结果，在门、科和属分类水平中选择前15个相对丰度最高的优势菌，其他菌群合并为Others，并用相对丰度柱状图展示(图3)。

图3 达乌尔黄鼠盲肠菌群在门(A)、科(B)和属(C)水平的相对丰度组成.不同的物种用不同颜色表示，柱子的长短代表该物种所占比例的大小；Others代表其他细菌分类以及未注释出来的细菌分类；星号表示科水平中未分类的属Fig.3 Composition of relative abundance of cecal microbiota in Daurian ground squirrel at phylum(A),family(B)and genus(C)levels.Different species are indicated in different colors,and the length of the column represents the proportion.Others represent other bacterial taxa and undefined bacterial taxa.Asterisks indicate unclassified genera at the family level

在门水平，达乌尔黄鼠盲肠菌群共注释到10个门类，包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、Patescibacteria菌门、Epsilonbacteraeota菌门和梭杆菌门(Fusobacteria)(图3A)。其中有5个菌门所占比例大于1%，分别为厚壁菌门(57.83%～82.25%)、拟杆菌门 (15.12%～33.57%)、疣微菌门 (0.48%～6.58%)、变形菌门(0.75%～1.53%)和放线菌门(0.37%～1.22%)，其他菌门的丰度较低(＜1%)。

在科和属水平，达乌尔黄鼠盲肠菌群中的厚壁菌门以毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、Familyす、消化球菌科(Peptococcaceae)、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)和氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)为代表。优势属包括克里斯滕森菌科R-7群 (ChristensenellaceaeR-7 group)、乳杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136群 (LachnospiraceaeNK4A136 group)、Marvinbryantia、毛螺菌科中的两个未分类属、[Eubacterium]coprostanoli-genesgroup、毛螺菌科UCG-008属(LachnospiraceaeUCG-008)、瘤胃菌科UCG-005属(RuminococcaceaeUCG-005)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus1)和瘤胃梭菌属9(Ruminiclostridium9)。在拟杆菌门中，主要由鼠杆菌科(Muribaculaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、理研菌科 (Rikenellaceae)和Barnesiellaceae菌科为代表，优势属包括鼠杆菌科中的未分类属、拟杆菌属(Bacteroides)和另枝菌属(Alistipes)。疣微菌门以艾克曼氏菌科(Akkermansiaceae)为主，且艾克曼菌属(Akkermansia)是其唯一的属。变形菌门以脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)中的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)为代表。放线菌门以Eggerthellaceae菌科为代表(图3B，C)。

通过比较不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的相对丰度，在不同分类水平中盲肠菌群的相对丰度存在季节性差异(表2)。其中，在门水平上，冬眠早期厚壁菌门的相对丰度相对于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期明显下降；拟杆菌门的相对丰度在冬眠早期显著高于除快速育肥期以外的其他时期；疣微菌门的相对丰度在冬眠早期和冬眠晚期显著高于出眠期，同时冬眠早期疣微菌门的相对丰度也显著高于快速育肥期。在科水平上，瘤胃菌科和Familyす的相对丰度在冬眠早期最低，在育肥完成期最高；消化球菌科的相对丰度在冬眠晚期显著高于起始育肥期和快速育肥期；乳杆菌科受冬眠的影响非常严重，其相对丰度从起始育肥期到冬眠晚期下降了近200倍；拟杆菌科的相对丰度在冬眠早期显著高于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期。在属水平上，Ruminococcus1的相对丰度在快速育肥期显著高于冬眠晚期，而与冬眠晚期相比，Marvinbryantia的相对丰度在育肥阶段的3个时期显著降低；[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相对丰度在快速育肥期降到最低，至育肥完成期又升到最高。拟杆菌属的相对丰度在冬眠早期显著高于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期。艾克曼菌属相对丰度的变化与疣微菌门一致。变形菌门中脱硫弧菌属的相对丰度在冬眠早期最高，在起始育肥期最低。

表2 在门、科和属水平中达乌尔黄鼠优势菌群相对丰度的差异比较Table 2 Comparison of relative abundance of dominant microbiota of Daurian ground squirrel at phylum,family and genus levels

2.4 PICRUSt功能预测分析

对不同时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的功能预测显示，IF、RF、FF、EH和LH组盲肠菌群的功能存在显著差异，且有差异的代谢通路有74个(图4)。其中，起始育肥期达乌尔黄鼠盲肠菌群在遗传信息的处理、复制和修复、核苷酸代谢等35个相关通路中显著富集；快速育肥期的盲肠菌群在新陈代谢、丁酸代谢、DNA复制蛋白等10个代谢通路中显著富集；育肥完成期达乌尔黄鼠盲肠菌群的功能有5个，即在细胞骨架蛋白、内分泌系统、膀胱癌、维生素B6代谢以及磷酸盐和次磷酸盐代谢中显著富集。冬眠早期的盲肠菌群在细胞过程和信号传导、磷酸转移酶系统、磷酸戊糖途径等12个功能通路中显著高于其他时期。在冬眠晚期中，达乌尔黄鼠盲肠菌群有12个代谢通路显著富集，包括环境信息处理、膜运输、转运蛋白等。以上结果表明，达乌尔黄鼠盲肠菌群的生物学功能和代谢途径存在季节性的差异。

图4 LEfSe分析KEGG三个层级中达乌尔黄鼠盲肠菌群显著富集的功能.LDA＞2认为有差异.IF：起始育肥期组；RF：快速育肥期组；FF：育肥完成期组；EH：冬眠早期组；LH：冬眠晚期组Fig.4 LEfSe analysis of the function of significant enrichment of cecal microbiota of Daurian ground squirrel at three KEGG levels.LDA＞2 is considered to be different.IF:Initial fattening group;RF:Rapid fattening group;FF:Finished fattening group;EH:Early hibernation group;LH:Late hibernation group

2.5 冗余分析

将达乌尔黄鼠不同时期的生理特征分别与存在显著差异的菌群组成和功能进行RDA分析(图5)。其中，达乌尔黄鼠的体重、摄食量、血糖和体温之间呈显著正相关。乳杆菌属、Ruminococcus1、瘤胃菌科和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相对丰度与摄食量、血糖和体温呈正相关，且这些菌种间呈正相关；乳杆菌属的相对丰度与体重呈显著正相关。拟杆菌属、艾克曼菌属、脱硫弧菌属和Marvinbryantia的相对丰度与体重、摄食量、血糖和体温呈显著负相关，且与乳杆菌属、Ruminococcus1、瘤胃菌科和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相对丰度呈显著负相关，而这些菌种间呈显著正相关(图5A)。同时，在起始育肥期和快速育肥期中显著富集的DNA复制、核糖体、嘌呤代谢、酪氨酸代谢和丁酸代谢与体重、摄食量、血糖和体温呈显著正相关，且这些代谢通路间呈显著正相关。而在冬眠早期和冬眠晚期中显著富集的氮代谢、ABC转运蛋白、硫代谢和磷酸转移酶系统与体重、摄食量、血糖和体温呈显著负相关，也与起始育肥期和快速育肥期中的代谢通路呈显著负相关，这些功能通路间呈显著正相关 (图5B)。

图5 达乌尔黄鼠不同时期的生理特征与其盲肠菌群组成(A)和功能(B)的冗余分析.红色箭头射线代表不同时期达乌尔黄鼠的生理特征；蓝色箭头射线分别代表盲肠菌群的组成和功能；不同颜色的点代表不同的分组；射线与射线之间的关系由夹角表示，锐角代表正相关，钝角代表负相关Fig.5 RDA analysis of physiological characteristics of Daurian ground squirrel in different periods and the composition(A)and function(B)of cecal microbiota.The red arrow rays represent the physiological characteristics of Daurian ground squirrel in different periods.The blue arrow rays represent the composition and function of cecal microbiota.Dots of different colors represent samples of different groups.The relationship between rays is indicated by the included angle,with acute angle representing positive correlation and obtuse angle representing negative correlation

3 讨论

达乌尔黄鼠为典型的储脂类冬眠动物，其活动具有明显的季节性，其极端的饮食和冬眠前后的生理变化可能使肠道内环境发生了改变，从而影响肠道菌群。本研究通过对6个时期达乌尔黄鼠盲肠菌群的多样性、组成和功能进行分析，探讨达乌尔黄鼠盲肠菌群的季节性变化。

3.1 达乌尔黄鼠盲肠菌群的多样性

本研究对各组达乌尔黄鼠盲肠菌群的Alpha多样性分析发现，出眠期Chao1指数和ACE指数显著高于起始育肥期、快速育肥期和冬眠早期，快速育肥期的Simpson指数显著高于育肥完成期。同时基于加权和非加权的UniFrac距离矩阵的PCoA分析显示，起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期的盲肠菌群结构相似，而冬眠早期和冬眠晚期的菌群结构相似性与育肥期差异较大，出眠期作为过渡状态，介于育肥期和冬眠期之间。以上研究结果表明，冬眠期达乌尔黄鼠盲肠菌群结构与育肥期明显不同，且盲肠菌群的多样性存在季节性差异。该结果与多纹黄鼠、北极黄鼠、棕熊(Ursus arctos)以及马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)的研究结果一致(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014;Sommeret al.,2016;Xiaoetal.,2019)。同时，盲肠菌群多样性的季节性变化与达乌尔黄鼠季节性的饮食相关。与育肥完成期相比，冬眠早期盲肠菌群的丰富度减少，可能受到冬眠期间禁食的影响。禁食对肠道菌群多样性的影响已经在多种动物中得到证实，Sonoyama等(2009)发现禁食96 h的金色中仓鼠(Mesocricetus auratus)肠道菌群的总数降低，禁食后缅甸蟒(Python bivittatus)肠道菌群的多样性降低(Costelloet al.,2010)，冬眠期多纹黄鼠肠道菌群的多样性显著低于春季(Careyet al.,2013)。达乌尔黄鼠在冬眠阶段处于禁食状态，以膳食纤维为主要营养来源的菌群减少，因此盲肠菌群的丰富度降低。出眠期达乌尔黄鼠盲肠菌群的丰富度最高，可能是达乌尔黄鼠在出眠期的进食增加，盲肠菌群对营养来源的选择增多。在育肥期达乌尔黄鼠持续摄食以及盲肠菌群之间竞争的情况下，优势菌群占据主导位置，使盲肠菌群组成趋于稳定且丰富度降低，该结果与多纹黄鼠和马铁菊头蝠的研究结果相似(Careyet al.,2013;Xiaoet al.,2019)。

3.2 达乌尔黄鼠盲肠菌群的组成

本研究中达乌尔黄鼠盲肠菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门组成。其中，厚壁菌门和拟杆菌门不仅在多纹黄鼠(Careyet al.,2013)、北极黄鼠(Stevensonet al.,2014)、东方田鼠(Alexandromys fortis)(冯洁等，2018)等啮齿动物中占优势，而且是许多哺乳动物的优势菌群，如大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)(Zhuet al.,2011)、棕熊(Sommeret al.,2016)、林麝 (Moschus berezovskii)(赵贵军等，2019)、野猪(Sus scrofa)(杨雄威等，2021)等。本研究显示达乌尔黄鼠季节性的生理变化使盲肠菌群的相对丰度发生改变。与其他时期相比，冬眠早期厚壁菌门的相对丰度减少，而拟杆菌门和疣微菌门的相对丰度增加。该结果与多纹黄鼠和北极黄鼠优势菌群的变化一致(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014)。瘤胃菌科和Familyす的相对丰度在冬眠早期最低，与其他时期相比，乳杆菌属的相对丰度在冬眠早期和冬眠晚期显著下降。Carey等(2013)发现，多纹黄鼠盲肠的乳杆菌属相对丰度从冬眠开始就下降到不可检测的水平，直到春季才逐渐增加。在北极黄鼠肠道菌群中，脱硫弧菌属的相对丰度在冬眠期显著高于夏季，这与达乌尔黄鼠的研究结果一致(Stevensonet al.,2014)。本研究中拟杆菌属、艾克曼菌属和脱硫弧菌属的相对丰度也在冬眠早期最高。冬眠期达乌尔黄鼠盲肠菌群的相对丰度发生改变，提示盲肠菌群可能参与了冬眠动物生理功能的调节。

3.3 达乌尔黄鼠盲肠菌群的功能通路

已有研究发现瘤胃菌科和乳杆菌属是植物多糖的主要利用者，可以降解膳食纤维，提高宿主的免疫能力(Danielet al.,2014；毛倩云等，2018)，同时它们通过产生丁酸等短链脂肪酸，刺激上皮细胞的增殖和恢复并维持肠壁的完整性(Sivaprakasamet al.,2017;Zhouet al.,2017)。本研究中，厚壁菌门的瘤胃菌科和乳杆菌属的相对丰度在育肥期显著高于冬眠期，且与摄食量和血糖呈正相关。Carey等(2013)发现，多纹黄鼠盲肠内容物中丁酸盐浓度与厚壁菌门呈正相关。夏季多纹黄鼠和北极黄鼠盲肠内容物中都发现丁酸盐浓度显著高于其他时期(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014)，这与本研究中丁酸代谢的功能通路在快速育肥期显著富集，且与体重、摄食量、血糖和体温4个生理特征呈显著正相关的结果一致。可见，育肥期达乌尔黄鼠的摄食量和血糖增加，厚壁菌门中的瘤胃菌科等肠道菌群产生了更多丁酸盐，其浓度在宿主的盲肠中增加，使达乌尔黄鼠盲肠菌群的丁酸代谢在快速育肥期富集并为其上皮细胞提供能量。此外，在功能预测和RDA分析中，DNA复制、核糖体、嘌呤代谢、酪氨酸代谢等功能通路在起始育肥期显著富集，且与体重、摄食量、血糖和体温呈显著正相关。有研究发现，乳杆菌属参与了氨基酸的脱羧作用并生成酪氨酸等生物胺，可以调节DNA和蛋白质的合成等生理功能，促进肠道稳态(Maet al.,2010；皮宇等，2017)。因此，乳杆菌属的相对丰度在起始育肥期最高，这对达乌尔黄鼠的生理和免疫功能是有利的。以上研究结果表明，育肥期富集的丁酸代谢等功能通路参与了达乌尔黄鼠的基础生命功能和营养物质运输，并为其提供能量。

本研究发现达乌尔黄鼠的摄食量和血糖与艾克曼菌属和拟杆菌属的相对丰度呈显著负相关，显示冬眠期禁食的达乌尔黄鼠盲肠艾克曼菌属和拟杆菌属的相对丰度增加。艾克曼菌属中的Akkermansia muciniphila可以降解宿主内源性聚糖，包括黏液中的多糖、脱落的上皮细胞以及胆汁和胰腺的分泌物等，刺激宿主粘液分泌，加强上皮细胞的完整性(Derrienet al.,2004;Geerlingset al.,2018)。拟杆菌属中的Bacteroides thetaiotaomicron在缺乏膳食聚糖的情况下可以降解宿主聚糖，协助宿主利用碳水化合物等营养物质，并有提高免疫应答和维持肠道微生态平衡的作用(Flintet al.,2012;Koropatkinet al.,2012)。可见，冬眠期间达乌尔黄鼠的摄食量、血糖降低，使可以降解宿主来源底物的艾克曼菌属和拟杆菌属的相对丰度增加，并提高达乌尔黄鼠的免疫能力，调节其生理代谢。此外，冬眠期显著富集的氮代谢与达乌尔黄鼠的体重、摄食量、血糖和体温呈显著负相关。尿素氮循环可以保持动物在冬眠中的蛋白质含量，防止冬眠期间氨中毒(Leeet al.,2012;Riceet al.,2020)。肠道菌群将宿主肠道中的尿素水解为二氧化碳和氨，氨可以进一步合成氨基酸，并有助于新蛋白质的生成(Carey and Assadi-Porter,2017;Reganet al.,2022)，说明在冬眠期间达乌尔黄鼠盲肠菌群可以通过氮代谢转换有毒物质，并为黄鼠提供部分能量。同时，Earley等(2015)研究发现脱硫弧菌属可以代谢粘蛋白的硫酸盐并产生硫化氢(H2S)。H2S作为一种典型的细胞色素C氧化酶抑制剂，与冬眠的代谢抑制有关(Nichollset al.,2013;Revsbechet al.,2014)。本研究中达乌尔黄鼠的脱硫弧菌属的相对丰度、硫代谢的功能通路与体重、摄食量、血糖和体温4个生理特征呈显著负相关。表明冬眠的达乌尔黄鼠盲肠脱硫弧菌属的相对丰度增加会促进硫代谢产生更多的H2S，以减少黄鼠在冬眠期间的能量消耗。以上研究结果暗示，冬眠期盲肠菌群可能通过增强氮代谢等功能，参与和调节达乌尔黄鼠的生理代谢，从而使黄鼠能够应对冬季的极端低温和食物匮乏。

致谢：感谢沈阳师范大学生命科学学院周瑜老师在生物信息学分析中提供的帮助！感谢生命科学学院任月同学在样本采集工作中给予的帮助！