YWHAZ在小鼠早期胚胎发育过程中的作用

赵怡凡，马增友，方俊博，孟碟方，彭 辉

(福建农林大学 动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002)

酪氨酸-色氨酸羟化酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，又称为YWHA蛋白)普遍存在于真核生物中且高度保守。YWHA蛋白通常以单体相对分子质量约为30 kDa的同源或异源二聚体形式存在。该蛋白家族在哺乳动物中有7个成员，分别为YWHAB、YWHAG、YWHAQ、YWHAH、YWHAZ、YWHAE和SFN[1-3]。YWHA蛋白又被称为磷酸化丝氨酸/磷酸化苏氨酸结合蛋白，有研究表明，YWHA蛋白可以与靶蛋白的磷酸化位点结合，如激酶、磷酸酶、跨膜受体、转录因子等[4]。通过蛋白质组学和生物化学方法已经检测到200多种可能与YWHA蛋白相互作用的蛋白质，这些蛋白参与调控细胞周期、信号转导、应激反应、细胞凋亡、细胞代谢等生命活动[5-6]。YWHA蛋白可结合特定的磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸序列，并通过改变靶蛋白细胞定位、改变酶活性和调节蛋白-蛋白相互作用来发挥功能[7-9]。

YWHAZ是YWHA蛋白家族成员之一，YWHAZ参与多种细胞信号通路，在细胞增殖和细胞周期中发挥作用[10]。有研究表明，C.elegans的PAR-5蛋白与哺乳动物中的YWHAZ蛋白高度同源[11]，PAR-5在C.elegans早期胚胎非对称发育中起重要作用，PAR-5蛋白水平显著降低会导致胚系缺陷和不育[12]。YWHAZ蛋白在哺乳动物早期胚胎发育过程中的研究尚未见报道，本试验通过RT-PCR、Western blot、免疫荧光和RNAi等方法研究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的表达、定位和作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性和雄性ICR小鼠购自福建省福州市闽侯县吴氏实验动物中心，小鼠饲养条件良好，自由采食及饮水，饲养过程中的昼夜明暗循环为14 h/10 h，室温控制在25℃。

1.2 主要试剂人绒毛膜促性腺激素(hCG)和孕马血清促性腺激素(PMSG)购自宁波第二激素厂；YWHAZ兔多克隆抗体和KSOM培养液购自Sigma；Ywhaz siRNA购自Santa Cruz；siPORTTMAmine Transfection Agent购自Applied Biosystems；CellAmpTMWhole Transcriptome Amplification Kit购自TaKaRa。

1.3 早期胚胎的收集与培养8～10周龄雌性小鼠腹腔注射10 IU PMSG刺激卵泡生长发育，48 h后注射10 IU hCG促排，将处理后的母鼠与公鼠合笼，14 h后检查阴道栓，采取脱颈法将有阴道栓的雌性小鼠处死。取出输卵管置于H-KSOM操作液中，在体视显微镜下用无菌的1 mL皮下注射器划破输卵管，释放卵丘卵母细胞复合体，再将卵丘卵母细胞复合体吸至透明质酸酶溶液中，消化卵丘细胞收集合子，将合子转移至平衡好的培养皿中，在37℃、5% CO2饱和湿度下恒温培养。

1.4 RT-PCR和qRT-PCR使用CellAmpTMWhole Transcriptome Amplification Kit试剂盒分别将10个1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚直接逆转录合成cDNA，然后对反转录的cDNA进行扩增。合成的cDNA按50倍稀释后作为模板分别进行RT-PCR和qRT-PCR扩增，特异性引物参见表1。

表1 基因特异性引物信息

1.5 Western blot检测收集1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚各50个，将胚胎加入含有全蛋白酶抑制剂(Roche)和IP裂解液(1∶25)的离心管中，冰上孵育2 min使胚胎充分裂解，再加入SDS上样缓冲液，煮沸变性10 min后进行SDS-PAGE电泳，用湿转法将目的蛋白转移到NC膜上，5%封闭液室温孵育4 h，之后将NC膜浸入一抗中4℃孵育过夜。0.1% TBST摇洗3次，IRDye®近红外荧光二抗按1∶10 000的比例稀释，NC膜浸入二抗溶液中室温避光孵育2 h。0.1% TBST摇洗3次后，再用TBS摇洗3次，将NC膜置于双色红外激光成像系统Odyssey CLx中曝光拍照。

1.6 免疫荧光检测收集1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚各10个，PBS洗涤3次，将各时期胚胎置于4%多聚甲醛溶液中固定1 h。之后将胚胎吸入0.1% Triton X-100中，室温孵育20 min，增加细胞膜通透性。通透打孔后的胚胎在免疫染色封闭液中室温封闭4 h，将封闭后的胚胎吸入一抗溶液中4℃孵育过夜。免疫荧光洗涤液摇洗3次后加入荧光二抗，室温避光孵育2 h。免疫荧光洗涤液摇洗3次，加入DAPI染色液染核10 min，免疫荧光洗涤液摇洗3次后将胚胎吸至载玻片上，滴加荧光抗淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.7 siRNA转染收集合子置于酸性台氏液中10～20 s消化透明带，然后向培养皿中加入1 mL H-KSOM终止消化，吸出合子用H-KSOM清洗2次备用。在Opti-MEM培养基中加入siPORTTMAmine Transfection Agent，室温孵育10 min。将siRNA加入到Opti-MEM培养基中。将上述配好的试剂1∶1混合，室温静置孵育10 min使siRNA和转染试剂充分结合。用Opti-MEM冲洗电转皿，最后吸取混合液加入电转皿的两根电极之间，再将合子加入到电转皿的凹槽中并使合子呈线性排列。电转仪的参数设置为：电压22 V、脉冲时间1 ms、脉冲间隔500 ms、脉冲次数3次。电转之后，用吸卵针吸出处理后的合子并在H-KSOM操作液中清洗，置于平衡好的KSOMaa培养液中，在37℃、5% CO2饱和湿度下恒温培养。

1.8 统计分析各试验均独立重复至少3次，所有分析均采用SPSS 19.0软件，使用单因素方差分析进行组间比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1YwhazmRNA及蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的表达利用RT-PCR方法对Ywhaz在小鼠早期胚胎发育过程中的表达进行检测，结果表明，YwhazmRNA在1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚中均有表达(图1A)。同时，提取不同时期早期胚胎的蛋白，经过SDS-PAGE电泳使蛋白分离，再通过Western blot检测YWHAZ蛋白表达情况，结果显示，在早期胚胎发育过程中均能检测到该蛋白的表达(图1B)。

A.Ywhaz mRNA在小鼠早期胚胎中的表达；B.YWHAZ 蛋白在小鼠早期胚胎中的表达

2.2 YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎中的定位取小鼠的1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚进行免疫荧光染色，研究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎中的定位。结果表明，YWHAZ蛋白定位在小鼠早期胚胎的细胞质和细胞核中(图2)。

蓝色荧光为细胞核；绿色荧光为YWHAZ蛋白

2.3YwhazsiRNA的沉默效率为了研究YWHAZ在早期胚胎发育过程中的作用，首先通过电转方式向1-细胞胚胎中转入YwhazsiRNA，检测基因沉默效率。结果显示，当YwhazsiRNA浓度达到0.7 μmol/L时，该基因的沉默效率为91%(图3A)。使用Western blot检测干扰组与阴性对照组的YWHAZ蛋白表达差异，结果表明，Ywhaz干扰培养24 h后，YWHAZ蛋白表达明显减少(图3B)。经Image studio软件分析显示，YWHAZ蛋白表达量减少了45%(图3C)。

A..沉默Ywhaz降低其mRNA水平的表达；B.沉默Ywhaz降低其蛋白水平的表达；C.YWHAZ蛋白在对照组和干扰组中的表达分析

2.4 沉默Ywhaz对小鼠早期胚胎发育的影响为了研究YWHAZ在小鼠早期胚胎发育过程中是否发挥作用，本试验将YwhazsiRNA转入1-细胞胚胎，之后在体外将其培养至囊胚。胚胎发育4.5 dpc时，其形态学特征如图4A所示。阴性对照组与干扰组之间发育情况存在明显差异，干扰组2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚的发育率极显著低于对照组(P< 0.01)。在4.5～5.0 dpc的过程中，对照组囊胚率无明显变化，而干扰组囊胚率显著增加，但

A.Ywhaz沉默后的胚胎培养4.5 dpc的形态学特征；B.培养不同天数的胚胎发育百分率；*P<0.05；** P<0.01

对照组与干扰组间仍存在显著性差异(P<0.05)(图4B)，表明沉默Ywhaz可导致小鼠早期胚胎发育率降低，虽大部分胚胎能发育到囊胚，但存在明显的胚胎发育延迟现象。

3 讨论

本研究通过RT-PCR和Western blot技术检测了YwhazmRNA及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎中的表达情况。结果发现，YwhazmRNA在小鼠胚胎发育过程中均有表达，并且表达较为稳定。本试验结果与Ywhaz基因在人、兔、牛等早期胚胎发育过程中的表达情况一致[13-15]。本研究结果显示，YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎的各个时期均有表达，同时定位于早期胚胎的细胞质与细胞核中，提示该蛋白可能在小鼠早期胚胎发育过程中发挥一定的作用。

小鼠受精卵在体内经过3.5 dpc可发育至囊胚，体外培养条件下需要4.0～4.5 dpc发育至囊胚。本研究采取1.5，2.5，3.0，3.5，4.5 dpc时观察2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚发育情况。结果显示，Ywhaz沉默组各时期发育率都显著低于对照组，表明沉默Ywhaz可导致小鼠早期胚胎发育率降低。将观察时间延长至5.0 dpc，沉默组囊胚率显著增高，但仍低于对照组，提示沉默Ywhaz可影响早期胚胎发育进程，囊胚发育延迟。有研究表明，YWHAZ蛋白通过与CDC25蛋白结合并调节其功能而参与了G1/S期转变和G2/M期转变，在有丝分裂间期发挥作用[16]。此外，YWHAZ与Polo样激酶1(polo-like kinase 1,Plk1)在有丝分裂过程中存在相互作用，并共同定位于胞质分裂过程中的中心体。YWHAZ的缺失导致细胞染色体分离滞后，处于胞质分裂期的细胞明显增多[17]，这也可能是沉默Ywhaz延迟早期胚胎发育的原因。

本试验虽然使用siRNA将Ywhaz基因的表达量降低了91%，但YWHAZ蛋白表达量仅降低了45%，早期胚胎中残留的YWHAZ蛋白可以继续支持早期胚胎发育。此外，YWHA家族成员在结构和功能上类似，不同的亚型可以与相同的配体结合。因此，YWHA家族其他成员也可能代偿了YWHAZ蛋白的功能，以致Ywhaz沉默组大部分胚胎仍可以发育至囊胚。研究表明，YWHAZ通过形成同源或异源二聚体与靶蛋白结合而发挥作用[18]。在早期胚胎发育过程中，YWHAZ也可能与其他蛋白形成复合体进而调节早期胚胎的发育，但该蛋白与何种蛋白形成复合体还有待于进一步的研究。

综上所述，本研究利用RT-PCR、Western blot、免疫荧光和RNAi技术阐明了YwhazmRNA及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的表达、定位和作用，揭示了在合子中沉默Ywhaz基因可导致小鼠早期胚胎发育率降低，且出现囊胚发育延迟现象。