国内主要石斛种类茎部有效成分石斛多糖的含量比较

熊文皙,黄清俊*,黄金龙,吴范宏,樊敏伟

(1.上海应用技术大学生态技术与工程学院，上海 201418；2.上海应用技术大学化学技术与工程学院，上海 201418; 3.上海中药制药技术有限公司，上海 201203)

石斛通常是指兰科石斛属(DendrobiumSw.)多年生草本植物的总称。其广泛分布于日本、韩国、印度与中国等。《中国植物志》[1]记载我国石斛属植物共有74种2变种，目前所有石斛中发现可药用约为51种，有三十余种石斛有可食用记录[2]。2020年版《中国药典》收录中药石斛为金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)、霍山石斛(D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)、流苏石斛(D.fimbriatumHook.)以及铁皮石斛(D.officinaleKimura et Migo.)的栽培品及其同属近似种的新鲜或干燥茎[3]。石斛具有珍贵的药用及保健作用，其“补虚，除痹下气，强阴益精，厚肠胃，轻身延年”，早在公元前200年，中药学著作《神农本草经》便提到石斛为一种滋补品，为止血收敛剂以及止痛、消炎类的物质[4]。

多糖为石斛发挥药效的有效成分之一，具有广泛生物效应。关于石斛多糖药物，随着现代药理研究的发展，石斛多糖从提高机体免疫力到如今发现具有降血压[5]、抗凝和抗血栓[6]、抗氧化衰老[7]以及抗肿瘤[8]和抑菌[9]等作用。自古以来石斛讲究“鲜品为上”，干鲜石斛滋阴生津之力大不同，近代研究发现鲜石斛多糖含量与干石斛差异不大，还原糖及生物碱含量却明显高于干品[10]；1977年开始至2020年，九版《中国药典》都收录鲜药石斛为药材饮片；因植物多糖具有特殊的理化性质，徐伟琴[11]以新鲜铁皮石斛为原料，多元化确定鲜石斛果胶较优提取工艺并用作增稠剂、乳化剂加以利用。

目前，直接处理鲜石斛后提取多糖相关研究较缺乏，多糖含量测定多基于从干石斛出发，大部分新鲜石斛多糖含量未有比较研究分析，含量测定也大多集中在鼓槌石斛[12]、铁皮石斛、金钗石斛[13]和流苏石斛[14]等。因此本实验现对国内主要26种(含一品种)新鲜石斛取样，进行多糖含量测定，以期发现更多具有潜在保健价值的石斛植物，为石斛植物多糖有效成分的种类完善、筛选和推广应用提供实验支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

石斛均为2018年从四川、云南和安徽分别引种栽培至上海应用技术大学玻璃温室(经上海应用技术大学生态技术与工程学院黄清俊教授鉴定)，栽培基质为草炭土、松树皮、陶粒的混合基质。于2020年9月，采集2年生石斛鲜茎段20 g，放入密封袋中立即带回实验室冰箱冷藏后备用。

1.2 仪器与试剂

UV-2405型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；TDL-5-A型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；FSH-2A可调高速匀浆机(常州市金坛友联仪器研究所)；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；D-无水葡萄糖(中国食品药品鉴定研究院110833-201908供含量测定用)；苯酚(上海凌峰化学试剂有限公司)；浓硫酸(国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 相对含水量测定

采用干燥法：首先取已100 ℃烘干30 min并冷却洁净后干燥的玻璃称量瓶，称定重量记为M1，后取健康无病害样品茎段，称定重量记为M。后将样品置于玻璃称量瓶中105 ℃杀青30 min，55℃烘干至恒重，冷却后称定总重量，记为M2。相对含水量=(M1+M-M2)/M*100%。

1.3.2 对照品溶液制备

取D-无水葡萄糖对照品溶液适量，精密称定，加蒸馏水制成每1 mL含100 μg的溶液，摇匀即得。

1.3.3 供试品溶液制备

取无病虫害并去除叶片的石斛鲜茎段约5 g，使用匀浆机反复搅碎，加蒸馏水150 mL，加热回流2 h，放冷，转移至250 mL容量瓶中，合并洗液后加水至刻度摇匀并过滤。精密量取续滤液10 mL置50 mL离心管中，再加入无水乙醇40 mL摇匀冷藏1 h后取出。5000 r·min-1离心20 min，弃去上清液。沉淀用8 mL 80%乙醇洗涤2次，离心10 min，弃去上清液。沉淀用热水溶解，转移至25 mL容量瓶中，放至室温后加水至刻度，摇匀后作为供试品溶液备用。

1.3.4 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水至1.0 mL，依次精密加入5%苯酚溶液1 mL(现用配制)和硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min后置冰水浴中冷却5 min[3]。以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2020年版四部通则0401)方法，在486 nm的波长处测定吸光度，以葡萄糖浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，得回归线方程为：y=8.3472x+ 0.1107(R2=0.9993)。如表1所示，葡萄糖检测浓度0.024～0.120 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

表1 线性关系Table 1 Linear Relationship Survey Results

1.3.5 多糖含量测定

分别精密量取各鲜石斛的供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，照1.3.4项下的方法，依次测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中D-无水葡萄糖的量，计算即得各鲜石斛多糖含量。

1.4 数据处理

通过SPSS 25.0统计学软件对26种石斛的多糖含量进行均值、方差统计处理，结果以平均值±标准偏差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 方法学考察

2.1.1 波长检测实验

精密量取供试品溶液1 mL，以D-无水葡萄糖溶液作对照，在300～600 nm进行扫描，得出供试品与对照品最大吸收波长为486 nm，因此486 nm为检测波长。

2.1.2 精密度实验

精密量取D-无水葡萄糖对照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞试管中，加水至1.0 mL，依法测定吸光度，连续测定6次，计算吸光度值的RSD为0.32%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性实验

取同批D6石斛适量，自1.3.4项下“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法分别于0,0.5,1,1.5,2,3 h计算吸光度值的RSD为0.44%(n=6)，稳定性良好。

2.1.4 重复性实验

取同批D6石斛粉末6份，每份约5 g，按1.3.4项下测定吸光度，计算多糖含量。结果RSD值为1.95%(n=6)，表明重复性良好。

2.1.5 加样回收率实验

精确称取9份已知总多糖含量的D6石斛多糖，准确加入一定量的葡萄糖对照品，制备样品溶液，测定吸光度，得平均回收率为100.50%，RSD值为1.88%(n=9)。

2.2 石斛多糖含量测定结果

测定结果见表2所示。所测26种石斛多糖含量介于0.044%～30.086%之间，差距高达30.042%，其中霍山米斛多糖含量(30.086%)最高，与其余25种石斛有显著性差异(P<0.05)，其次为铁皮石斛(20.344%)、报春石斛(18.025%)和密花石斛(17.427%)。多糖含量在10%以上的有7种，除以上的4种外，还有矩唇石斛、蜻蜓石斛和血喉石斛。多糖含量在1%～10%之间的有10种，包括霍山铁皮石斛、球花石斛、鼓槌石斛和流苏石斛等。其余9种石斛均低于1%，之间无显著性差异(P>0.05)，最低为反瓣石斛(0.044%)。相较于王再花[15]、吴刚[16]、王晓媛[17]、秦向东[18]、姚亮[19]和金海英[20]的研究，本实验首次新增测定矩唇石斛(13.028%)、血喉石斛(10.976%)、晶帽石斛(4.993%)、龙石斛(3.106%)、红牙刷石斛(0.528%)和金石斛(0.531%)的多糖含量，其中包含《中国植物志》中未收录的红牙刷石斛、龙石斛和血喉石斛。

表2 26种石斛(含一品种)多糖含量测定结果Table 2 The polysaccharide contents of 25 kinds of Dendrobium Sw.(contains a variety) and Flickingeria comata (Bl.) Hawkes

3 讨论与结论

3.1 关于石斛多糖的测定

根据DB34/T 486-2016霍山石斛安徽地方标准，霍山米斛为著名道地产区安徽省霍山县所产霍山石斛中3种石斛之一，其在所测26种石斛中多糖含量最高，为30.086%，其多糖含量高于2020年版《中国药典》所规定的25.0%，略高于姚亮(28.33%)[19]测量干品多糖结果，可见遗传因素是霍山米斛多糖含量的决定性因素，因此多糖可作为霍山米斛的特征性成分，具有潜在保健药用开发价值。

铁皮石斛多年来一直是研究热点之一，也是保健市场主销产品，主要原因是它的石斛多糖含量比较高，研究表明铁皮石斛多糖含量多在20%～50%[21]之间，本实验测定多糖含量为20.344%，与云南品系干品多糖结果相较，高于李杰(17.9%)[22]低于陈丹(35.64%～39.39%)[14]、刘文杰(30.63%～35.87%)[23]的研究结果，与徐雅囡(21.85%)[24]、吴建国(15.46%～29.27%)[25]测定结果相似。霍山铁皮石斛与铁皮石斛是同一个生物种，霍山铁皮石斛产地是安徽霍山，但此次实验其石斛多糖含量不及四川来源的铁皮石斛。所以，即使同种石斛，石斛多糖的含量与产地密切相关，不同来源地的石斛多糖含量显著不同。

在提取多糖和测定方法相似，产地同为云南情况下，密花石斛、鼓槌石斛、金钗石斛、球花石斛多糖含量与王再花[15]测定干品多糖研究结果相比，密花石斛多糖测定结果(17.427%)明显高于王再花(11.8%)，其余均低于；将本实验产地为四川的鲜品流苏石斛(3.366%)与源自云南和缅甸干品相比，多糖含量高于产地为云南(2.43%)[15]，低于产地为缅甸(26.9%)[17]，说明石斛不同形态对多糖含量具有较大影响。在不同提取多糖和测定方法情况下，孙卓然[26]与本实验中球花石斛与叠鞘石斛产地均为四川，但多糖含量(18.96%；16.32%)远高于本实验结果，因此多糖含量与提取方式和测定方法息息相关。

本实验中球花石斛(5.021%)与蜻蜓石斛(12.268%)多糖含量高于龚恒佩(4.42%)[27]与王晓媛(6.92%)[17]测定结果；李杰[22]测定的大苞鞘石斛(24.3%)，滕建北[28]测定的鼓槌石斛(30.65%)，秦向东[18]测定的棒节石斛(9.6%)，王晓媛[17]测定的杓唇石斛(15.98%)、叠鞘石斛(23.51%)，吴刚[16]测定的金钗石斛(39.39%)和王再花[15]测定的肿节石斛(39.1%)、报春石斛(23.2%)、杯鞘石斛(14%)、束花石斛(9.3%)和反瓣石斛(2%)均高于本实验结果，并有明显差异，可见石斛多糖含量受遗传特性、种质来源和提取方式影响极大。

3.2 关于石斛多糖的提取方式

就提取方式而言，本实验直接处理鲜石斛进行多糖提取，因为石斛鲜茎条中含有黏液成分可直接食用，加工为干品后其黏液成分被固化而稳定，使有效成分不易分解，营养成分多糖不能完全释放，造成了极大的浪费[29]。实验处理材料上较传统方式而言，更加便捷易操作，但是鲜石斛存在有氧呼吸消耗多糖的情况，这可能导致部分石斛多糖含量有所偏低。在提取多糖和测定方法相似情况下，就霍山米斛而言，本实验测定结果略高于姚亮[19]使用干品测量结果；铁皮石斛多糖含量与李晓军(25.46%～26.55%)[30]同样直接测定鲜品和徐雅囡[24]使用干品测定结果接近，为徐程(7.05%)[31]测定鲜品多糖含量的2.8～5.1倍；王再花(6.5%)[15]与龚恒佩[27]测定球花石斛干品多糖时，含量与本实验差异较小。因此，直接使用新鲜石斛提取多糖进行含量测定具有可行性，但需要对具体的石斛品种和提取方式进一步深入判断分析，在使用具体石斛药材时，也需根据其品种的具体药性药效决定。

3.3 结论

本实验直接从鲜石斛提取多糖进行含量测定，测定达26种石斛，涵盖国内主要的石斛种类。基于石斛茎部多糖有效成分含量指标，霍山米斛(>30%)为石斛中品质优良石斛种类；本实验首次报道测定了矩唇石斛(13.028%)，血喉石斛(10.976%)，晶帽石斛(4.993%)，龙石斛(3.106%)，红牙刷石斛(0.528%)和金石斛(0.531%)的多糖含量。石斛多糖的测定为石斛应用筛选提供了实验基础，而石斛多糖其潜在保健药用价值有待研究和挖掘，相关鲜药保鲜技术、鲜药饮片与鲜药制剂的研发技术还有待进一步加强。