基于顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分析山乌桕蜜挥发性成分

罗丽萍，乔 宁，郭利敏，刘 韬,3

(1.南昌大学生命科学学院，江西 南昌 330031；2.赣州海关，江西 赣州 341000； 3.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000)

山乌桕(Triadicacochinchinensis)是我国南方夏季的主要蜜源植物之一，通常 4～6月份开花，其群体花期可维持30～40 d，花单性，雌雄同株，其花序可生长至4～9 cm。山乌桕主要分布于我国江西、浙江、福建、台湾、广东、广西、云南及贵州等长江以南各省区，此外印度、缅甸等国也有分布，其叶片在秋冬季落叶之前由淡绿色转变为鲜红色，因此又称为红叶乌桕[1]。山乌桕群体花期较长，泌蜜量大，夏季大流蜜期强群产量更可高达25 kg/群。虽然产量较大，但山乌桕蜜的润喉性较差，结晶粒较粗，因此售价较低，销量增长缓慢。目前对于山乌桕蜜的研究主要集中在食品加工领域，研究人员以山乌桕蜜为发酵基质，筛选合适的菌种，开发蜂蜜酒和醋等产品[2-4]。作为发酵原料虽然可以部分解决销量问题，但是限于酿酒的成本控制，无法从根本上解决山乌桕蜜售价低，蜂农效益较低的困扰。

蜂蜜的气味是其感官特征的重要组成部分，赋予了蜂蜜独特的风味，也直接影响了人们的购买选择。气味成分主要来源于植物，在加工储存过程中由于温度、酶以及微生物的作用，其组成和含量也会发生改变。近年来，随着对单花蜜独特的风味和药理特性的深入研究，消费者对单花蜂蜜的需求不断增加，极大地增加了其商业价值，但是也造成了以次充好的现象，而气味成分作为蜂蜜最典型的指纹图谱之一，研究人员已将其作为蜂蜜植物源鉴别的有效工具。

蜂蜜中含有600多种挥发性化合物，种类包括：烃类、醛类、高级醇类、酮类、脂肪和其他羧酸类、酯类、苯及其衍生物(呋喃和吡喃)、类异戊二烯类、倍半萜及其衍生物和硫等化合物[5]。这些化合物给蜂蜜带来了不同的风味：如乙酸会带来辛辣的风味，而丁酸和己酸具有酸败的哈喇味[6]。研究人员最初采用同时蒸馏萃取(Simultaneous Distillation-Extraction，SDE)的方式分析蜂蜜中的挥发性成分，但是高温的提取方式会产生糠醛类物质[7]。另一种采用超声波溶剂萃取(Ultrasonic Solvent Extraction,USE)的方法能够显著降低提取时间、提高萃取效率，但是提取溶剂(如丙酮、氯仿等)较为昂贵且具有毒性，萃取物也常含有非挥发性化合物不适宜用于气相分析[8]。随着技术的进步，顶空(Headspace)、固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)和固相微萃取(Solid Phase Micro-Extraction，SPME)等方式也应用于蜂蜜气味分析中。SPME具有提取效率高、无需复杂预处理步骤以及可以耦合气相、液相和质谱类分析仪器的优点，它与顶空结合，能够使萃取头免受蜂蜜中糖基质的影响，是目前主流的分析方法。

Machado等通过比较不同研究中单花蜜特征气味物质出现的频率，描述列举了每个样品中5种主要的化合物，总结了20种不同植物源蜂蜜的气味特征。作者推测顺式芳樟醇氧化物、3-甲基-3-丁烯-1-醇和庚醛是洋槐蜜的特征性挥发性化合物；3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和异戊酸是荞麦蜂蜜中最常见的成份；另外，部分挥发物如：苯甲醛、糠醛、辛烷、壬烷、2-苯乙醇、壬醛或苯乙醛在不同的单花蜂蜜中都能检测到，因此它们不适合作为单花蜜的标记物[9]。

山乌桕蜜的挥发性成分尚未有研究报道，因此本文以山乌桕、枣树、荆条、洋槐、油菜和椴树蜜为实验材料，通过SPME和气相色谱质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)技术，以期找到山乌桕蜜的特征挥发性化合物以及共有物质，并通过化学计量学建立6种蜂蜜的植物源鉴别方法，为蜂蜜挥发性化合物的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂蜜样品：从江西、山东、湖北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、河北、河南、和内蒙古等省份的养蜂人处实地采集样本52份，从专业市场购买样本14份。按蜜源和数量进行编号，其中山乌桕蜜样品12份(TC1-12)、枣树蜜样本10份(JU1-10)、椴树蜜样本14份(LI1-14)、荆条蜜样本10份(CA1-10)、洋槐蜜样本13份(AC1-13)、油菜蜜样本7份(RA1-7)。样本保存于4℃冰箱备用。

实验主要试剂：分析级氯化钠、正辛醇购于上海沪试实验室器材有限公司，C7-C40正构烷烃混合标准品购于O2si公司，50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头(1 cm)购于Supelco公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS(7890A-7000C)，美国安捷伦科技有限公司；GC多功能自动进样器(RTCPAL)，瑞士思特斯分析仪器有限公司；电子分析天平(BSA224S)，德国赛多利斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蜂蜜挥发性成分萃取

40℃水浴中均质化蜂蜜样本，称取5.0 g用蒸馏水溶解并定容至10 mL，配置成浓度为0.5 g·ml-1的蜂蜜水溶液。

将10 mL蜂蜜水溶液转移至20 ml顶空瓶中，加入200 μl(10 μg·ml-1)正辛醇内标溶液，置于自动进样器中并设定：萃取前老化30 min，加热温度65℃，平衡时间15 min，振摇速度250 r·min-1，萃取深度20 mm，萃取时间55 min。

1.3.2 仪器分析方法

萃取完成后转移至GC进样口解吸，时间3min，解吸深度35 mm。气相采用脉冲不分流模式，采用30 mHP-5MS-UI非极性毛细管色谱柱，前进样口温度为250℃，色谱柱流量1.5 ml·min-1,氦气流量2.25 ml·min-1，氮气流量1.5 ml·min-1。质谱采用MS1 SCAN 模式，质量范围30～500 U，离子源温度250℃，传输线温度250℃。气相梯度升温程序：起始温度45℃并保持2 min，后以3℃·min-1速率升至180℃，后以10℃·min-1,速率升至250℃，以300℃后运行3min，共计57 min。

1.4 数据处理与统计

采用Masshunter采集数据并通过UnknownsAnalys软件对数据进行解卷积、峰提取、峰识别和保留指数计算等批处理，通过比对NIST14质谱数据库以及保留指数建立本地数据库。每个样品重复测定3次，汇总山乌桕蜜等其他5种蜂蜜的物质信息和组分面积，采用非参数检验方法(Wilcox test)比较山乌桕蜜与其他5种蜂蜜之间的组分含量差异。采用偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)建立6种植物源蜂蜜的判别模型，利用受试者工作曲线(Receiver Operating Curve ,ROC)的曲线下面积(Area Under Curve ,AUC)比较分类模型性能。

2 结果与讨论

2.1 山乌桕蜜的特征挥发性成分

山乌桕蜜中共计检出气味化合物29种，图1为山乌桕蜜典型挥发性成分色谱图，标注1～12的峰为所有山乌桕蜜样品中检出频率大于50%的成分。

t/min图1 山乌桕蜜典型挥发性成分色谱图Figure 1 Typical chromatograms of volatile components of Triadica cochinchinensis honey

经数据库检索、对比碎片峰和保留指数：峰1～4分别鉴定为异戊醇，2-甲基-1-丁醇，正辛醛，β-苯乙醇，它们的检出频率均大于90%，应为山乌桕蜜中常检出挥发性化合物；峰5～12分别鉴定为壬醛、2,5-二甲基苯甲醛、乙酸苯乙酯、苯乙醛、十六酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、壬醇和正庚醛(表1)。

表1 山乌桕蜜主要挥发性成分Table 1 Themainvolatile components of Triadica cochinchinensis honey

正辛醛、β-苯乙醇、壬醛和乙酸苯乙酯的解卷积色谱峰和质谱碎片比对见图2。

图2 解卷积提取峰3(A)、4(B)、5(C)和7(D)的色谱图、质谱峰与数据库比对Figure2 The chromatograms and mass spectra of peaks 3(A),4(B) ,5(C)and 7(D) were extracted by deconvolution and compared with the database

对比12种成分在其他5种蜂蜜中的检出频率和峰面积(表2)，正辛醛、β-苯乙醇和壬醛在6种蜂蜜样品中检出频率均大于70%。据文献调研，张丽珍等[3]在山乌桕蜂蜜醋中同样检出这3种成分，且β-苯乙醇的相对含量达到16.42%。史莹等[4]从山乌桕蜂蜜酒中检出β-苯乙醇和壬醛，并且认为具有较强新鲜果香和蜂蜜香味的己酸乙酯可构成酒的典型香气。另有研究表明辛醛和壬醛是洋槐蜜和松树蜜中主要挥发性成分之一[10,11]。任佳淼等[12]在16种不同蜜源蜂蜜中均测定到β-苯乙醇。陈奇奇等[13]发现壬醛是枣树花样品的共有成分之一。正辛醛属于脂肪醛类，具有强烈的脂肪和水果香气，在浓度较低时具有令人愉悦的甜橙香气，在茶树、柑橘等植物精油中普遍存在，主要用于柑橘类香料的调和。与正辛醛类似，壬醛具有强烈的蜜蜡花香和甜橙气息，其稀乙醇溶液有香草醛香调。

表2 12种成分在6种蜂蜜中的检出频率(A)和平均相对面积比较(B)Table 2 Comparison of detection frequency (A) and average relative area (B) of 12 components among 6 kinds honey

天然的β-苯乙醇主要存在于显花植物的花果和提取的精油中，具有蜂蜜香气，同时也是许多成熟水果玫瑰香味的主要来源，因此常用于食品、化妆品、烟草等产品[14]。研究表明β-苯乙醇在植物中的合成代谢起始于苯丙氨酸。Wahlberg等[15]发现随着陈化的进行，烤烟中的苯丙氨酸和木质素由苯丙氨酸裂解酶催化生成苯甲酸、苯乙醛、β-苯乙醇等香味物质。Tieman等[16]通过同位素示踪法研究了番茄中苯丙氨酸—苯乙胺—苯乙醛—β-苯乙醇的合成途径以及相应的3个关键酶芳香族氨基酸脱羧酶(Aromatic amino-acid decarboxylase,AADC)、单胺氧化酶(Monoamine oxidase,MAO)和苯乙醛还原酶(Phenylacetaldehyde reductase,PAR)。根据AADC的基因序列信息，杨晓等[17]从葡萄中克隆了控制β-苯乙醇合成的关键酶基因片段，证明在葡萄成熟及后熟阶段随着AADC的表达量增高，启动了苯丙氨酸代谢合成β-苯乙醇。

植物源挥发性有机物(Biogenic volatile organic compounds,BVOCs)是植物体内通过次生代谢途径合成的沸点低、挥发性强的小分子化合物。研究表明，不同的植物器官，如叶片、花瓣和花粉，释放的BVOCs不尽相同，花主要释放萜类、醇类、酯类和烃类等，枝叶主要释放萜类、醛类和醇类等[18]。

因此我们推断这3种物质主要来源于植物。将3种物质的峰面积进行对数转换(log2)，将5种蜂蜜与山乌桕蜜进行非参数差异检验(图3)，山乌桕蜜中正辛醛的含量显著高于洋槐蜜，β-苯乙醇的含量显著低于椴树和荆条蜜，壬醛含量均显著低于其他样品。结合3种物质的气味属性，我们推测由正辛醛、β-苯乙醇和壬醛构成了蜂蜜的基调香气，呈现了蜂蜜固有的蜜香和花香，但是含量的差异也使不同蜂蜜的基香出现分化。国际蜂蜜委员会规范定义了蜂蜜的气味，比如花香可以分为稀薄和浓郁，芳香可以分为辛辣、木质、树脂和香脂，果香可以分为新鲜、柠檬和甜蜜等。也有研究人员认为果香和花香并不能很好地区分蜂蜜，一些如焦糖、烟熏、蜂胶和辛辣味能够更好地反应蜂蜜在提取过程中发生的美拉德反应[19-20]。

注：图中5种蜂蜜与山乌桕蜜组进行非参数秩检验(wilcoxon test)比较其各组分的差异，其中ns表示差异不显著；*，**，***，****分别表示p<0.05，0.01，0.001，0.0001.图3 6种植物源蜂蜜中正辛醛(A)、β-苯乙醇(B)与壬醛(C)的峰面积(log2)对比Figure3 Comparison of the peak area (log2) of n-octanal(A),β-phenylethyl alcohol (B) and nonanal (C) in 6 botanical originkinds honey

对比其他9组分可知，山乌桕蜜具有以下特征：(1)、异戊醇和2-甲基-1-丁醇检出频率>90%，但其峰面积均小于油菜蜜；(2)、2,5-二甲基苯甲醛和乙酸苯乙酯检出频率>70%，但其峰面积均小于椴树蜜；(3)、苯乙醛和十六酸乙酯检出频率>60%，但苯乙醛的峰面积显著小于荆条蜜且与枣树蜜接近，十六酸乙酯的峰面积显著低于油菜蜜；(4)、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环和正庚醛检出频率>50%，且在其他5种蜂蜜中均未检出。在山乌桕蜜中，正辛醛、苯乙醇、壬醛和乙酸苯乙酯的峰面积分别占12种组分的37.45%，44.20%，1.27 %和7.64%且总和大于90%。因此上述2种成分面积虽然显著高于其他5种蜂蜜，但是其面积占比在组内相对较小(0.40 %和0.31%)。壬醇的检出频率>50%，但其峰面积显著小于枣树和荆条蜜，与油菜蜜较为接近。

综上所述，山乌桕蜜的气味特征主要呈现：清香带甜，这主要由苯乙醇为主体贡献；甜香浓厚，由乙酸苯乙酯等贡献；贯穿整体的花香和木香则由壬醛、正庚醛提供；稀薄的奶香气息则由异戊醇和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环贡献；因缺乏5-甲基糠醛和2-乙酰基呋喃等化合物，因此不具有焦糖香。

2.2 6种蜂蜜植物源鉴别分析

将山乌桕蜜中检出频率大于50%的成分与5种单花蜜进行了频率以及峰面积的对比分析后，发现不同植物源蜂蜜之间具有基调相同的气味成分：正辛醛、β-苯乙醇和壬醛，但其他组分特征差异明显。基于上述结果，综合6种蜂蜜的81种挥发性成分，采用PLS-DA方法建立山乌桕蜜等6种蜂蜜的分类模型，结果显示：

(1)样品总体可分为3类(图4-A)，其中椴树蜜与其他5种植物源蜂蜜区分界限明显。以分类模型下的主成分1、2和3绘制单个植物源蜂蜜与其他5种植物源进行区分时的ROC曲线(图4-B)，并积分计算其曲线的AUC值。椴树蜜的AUC值为0.9979，说明本模型可以有效区分椴树蜜与其他5种植物源蜂蜜。载荷向量图(图4-C)显示相较于其他蜂蜜，玫瑰醚、顺式玫瑰氧化物、薄荷呋喃和异柠檬醛等26种化合物是椴树蜜中的特征性化合物，它们在本分类模型中贡献较大；

图4 6种植物源蜂蜜PLS-DA区分模型的得分图(A)、受试者工作曲线(B)和载荷图(C)Figure4 Scoreplot(A) ,receiver operating curve(B) and loading plot (C)of PLS-DA discrimination model of 6 kinds of botanical origin honey

(2)荆条蜜和枣树蜜样品分布区域较为接近，它们的AUC分别为0.8482和0.9407，说明本模型区分枣树蜜的性能要高于荆条蜜，但两者均低于椴树蜜。其中壬醛、苯乙醛和对甲苯甲醚以及烟碱甲腈、癸醛和辛烷等化合物分别对荆条和枣树蜜的区分起到较大贡献；

(3)山乌桕蜜和油菜蜜样品分布区域接近，它们的AUC值分别为0.9979和0.9909。可知本模型可以有效区分中山乌桕蜜和油菜蜜。山乌桕蜜中的正庚醛和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环是其特征化合物，对其区分起到较大作用，它们的载荷值分别为0.049和0.047，这与单变量对比分析一致。洋槐蜜气味偏淡且成分含量偏低，特征物质较少，且与其他植物源蜂蜜重合区域较多，分布于5种蜂蜜聚类中心，其AUC值为0.7239，说明本模型对洋槐蜜的区分性能低于其他5种蜂蜜。

3 结论

本文通过GC-MS技术对比了山乌桕蜜与5种蜂蜜挥发性成分的共同点和差异性。发现6种蜂蜜共有的成分为正辛醛、β-苯乙醇和壬醛，它们构成了蜂蜜的基调香气，贡献了蜂蜜独有的蜜蜡香和水果玫瑰香味。山乌桕蜜特征性成分为正庚醛和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环。基于81种挥发性化合物组成建立的分类模型能够有效区分包含椴树蜜、山乌桕蜜、油菜蜜、荆条蜜和枣树蜜在内的5种蜂蜜。实验结果为山乌桕蜜的气味研究提供了基础数据，阐述了蜂蜜具有的基调气味成分，为蜂蜜挥发性化合物的深入研究提供参考。