表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建与鉴定

乔麒龙，黄 庆，王白玉，杨盼盼，赵月政，王宝玲，崔丽瑾，苗玉和，赵 军* (.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046；.福建圣维生物技术有限公司，福建 南平35400)

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。IBDV主要感染3～6周龄的雏鸡，感染后导致雏鸡中枢免疫器官法氏囊严重受损，B淋巴细胞功能损坏，从而导致机体产生免疫抑制、引起其他病原的继发感染。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组包括A、B 2个节段。A节段编码VP2、VP3、VP4和VP5 4个蛋白。其中VP2是IBDV的衣壳蛋白和主要的宿主保护性抗原，能够诱导机体产生保护性中和抗体，是研制IBD基因工程疫苗的首选靶抗原[2-3]。随着疫苗的广泛使用，IBD的流行出现了新的变化。20世纪90年代出现的以急性、高致死率为临床特征的IBDV超强毒株逐渐被新型变异株所取代，非典型IBD不断出现[4-5]。IBDV新型变异株感染鸡无明显临床症状，但可造成中枢免疫器官法氏囊的严重萎缩导致严重的免疫抑制，对我国养禽业造成严重威胁。因此研发针对我国流行的IBDV新型变异毒株引起IBD疫苗具有现实意义。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的能够感染各种禽类的急性、高度接触性和致死性传染病，严重危害我国和世界养禽业的健康发展[6-7]。NDV颗粒表面的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)是2种重要的功能性糖蛋白，在病毒感染、装配、出芽、决定宿主和组织嗜性等方面发挥重要作用。F蛋白介导病毒—细胞和细胞—细胞的融合，且与NDV的毒力直接相关。HN蛋白是1个多功能蛋白，在病毒感染过程中发挥重要作用，参与识别细胞表面的唾液酸受体，促进F蛋白的融合活性；HN蛋白的神经氨酸酶活性可以去除子代病毒颗粒上的唾液酸，防止病毒颗粒自我凝集[8-11]。NDV目前只有1个血清型，但根据F基因的差异可以区分为18个基因型，目前我国禽群中NDV主要流行株以基因Ⅶ型为主[12-13]。

疫苗免疫是防控IBD和ND的重要手段。现有的商品化IBD和ND疫苗包括单联或多联的弱毒活苗和灭活疫苗。与单苗相比较，多联疫苗在控制混合感染和降低疫苗接种劳动强度、减少动物应激等方面具有显著优势。传统的多联疫苗生产需要分别制备多种抗原，生产工艺繁琐，生产成本高。IBDV变异株的高效分离和高滴度培养目前还存在一定困难，基于IBDV VP2蛋白的亚单位疫苗存在纯化成本高和内毒素导致的安全隐患等问题。利用合适载体制备的基因工程多联疫苗能够克服传统多联疫苗制备工艺的缺陷。国内外利用基因Ⅱ型NDV LaSota疫苗株作为载体构建了表达多种外源基因的基因工程多联疫苗[14-15]。但由于我国鸡群中普遍存在高水平抗NDV LaSota株母源抗体和LaSota株疫苗不能有效控制我国目前流行的基因Ⅶ型NDV的感染等原因[16]，使得基于LaSota株的重组活载体疫苗的临床应用受到限制。虽然我国已经有商品化的防控基因Ⅶ型NDV的单联灭活疫苗[17]，但由于新兽药证书的限制和安全性的问题，目前国内尚没有防控基因Ⅶ型NDV的多联灭活疫苗和弱毒活疫苗。综合上述因素，我们前期利用反向遗传技术将LaSota疫苗株的HN和F基因分别替换为基因Ⅶ型NDV强毒株的HN基因和带有蛋白酶裂解位点氨基酸突变的F基因，构建了含有基因Ⅶ型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株—LaSota-ⅦF/HN。在证明其安全性和免疫原性的基础上，将优化合成的不同IBDV流行变异毒株VP2基因共有序列插入到LaSota-ⅦF/HN基因组中，构建出能够表达IBDV流行变异毒株VP2蛋白的重组嵌合型NDV，以期作为多联疫苗制备用种毒为研发有效防控IBDV变异株和基因Ⅶ型NDV感染的廉价高效疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒BHK-21细胞、NDV LaSota疫苗株和表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3均由河南农业大学动物医学院传染病教研室保存。

1.2 主要试剂和材料含有基因Ⅶ型NDV毒株F和HN基因的嵌合型NDV LaSota-ⅦF/HN全长基因组cDNA的质粒pNDFL-ⅦF/HN、表达LaSota株NP、P和L蛋白的辅助质粒pCIneo-NP-P-L[18]、pGEM-PM穿梭载体和含有中国近年来IBDV流行变异毒株VP2基因共有序列的质粒pUC-VP2均由本实验室构建。pGEM-PM穿梭载体含有NDV LaSota株的P和M部分基因以及2者之间的非编码区，在P和M序列之间引入额外的NDV基因终止(GE)和基因起始(GS)序列，并在GE和GS下游引入2个SapⅠ限制性内切酶位点以方便外源基因的插入。IBDV VP2单克隆抗体由河南农业大学禽病研究所制备。SapⅠ、ApaⅠ和PmlⅠ限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司；DNA胶回收试剂盒及质粒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Lipofectamine 3000转染试剂盒购自Thermo Fisher公司；病毒基因组RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；SPF鸡胚购自山东昊泰实验动物繁育有限公司；HRP酶标记羊抗鼠IgG购自Proteintech Group公司；ECL化学发光显色试剂盒购自Milipore公司。

1.3 表达VP2蛋白的重组NDV 感染性克隆的构建以pUC-VP2质粒为模板，利用带有SapⅠ限制性内切酶位点的特异性引物(表1)进行PCR扩增VP2基因。VP2基因经SapⅠ酶切后克隆至pGEM-PM质粒中获得pGEM-PM-VP2重组质粒；然后利用ApaⅠ和PmlⅠ分别双酶切pGEM-PM-VP2和pNDFL-VIIF/HN质粒，将IBDV VP2基因克隆至pNDFL-ⅦF/HN载体中，构建含有IBDV变异毒株VP2基因的重组NDV全长感染性克隆，将ApaⅠ和PmlⅠ双酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pNDFL-ⅦF/HN-VP2(图1)。

表1 引物序列及相关信息

图1 含有VP2基因的重组NDV基因组全长感染性克隆构建示意图

1.4 重组NDV的拯救将BHK-21细胞培养于6孔细胞培养板内生长至80%单层时，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3(MOI=1)感染细胞1 h，吸弃重组痘苗病毒vTF7-3感染物，然后将2 μg转录质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2与2 μg 辅助质粒pCIneo-NP-P-L按照Lipofectamine 3000转染试剂盒操作说明共转染BHK-21细胞。转染后24 h，弃去转染混合物，用PBS洗涤细胞2次，加入含有2%胎牛血清的MEM培养基继续孵育至96 h，收获培养物上清，接种10日龄的SPF鸡胚并培养120 h，收获HA阳性尿囊液即为拯救的重组病毒rChiLaSota-VP2。

1.5 rChiLaSota-VP2的鉴定

1.5.1rChiLaSota-VP2的RT-PCR鉴定 利用病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取LaSota株尿囊液和rChiLaSota-VP2鸡胚尿囊液的总RNA。针对IBDV VP2基因插入位点两侧基因序列设计鉴定引物JD-F： 5′-GGAAAATCAAGCGCCTTGCTC-3′和JD-R：5′-GACGATCGGAAATGCTAACAGG-3′，进行RT-PCR；对PCR产物进行序列测定，以鉴定IBDV VP2基因是否正确插入。

1.5.2rChiLaSota-VP2的Western blot鉴定 为了验证rChiLaSota-VP2是否成功表达IBDV强毒株的VP2 蛋白，分别取rChiLaSota-VP2鸡胚尿囊液、LaSota株鸡胚尿囊液进行SDS-PAGE，将蛋白电转印至硝酸纤维素(NC)膜上，以抗VP2单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot，并利用ECL试剂盒进行显色并拍照。

1.6 rChiLaSota-VP2的生物学特性分析为了评估重组NDV rChiLaSota-VP2的生物学特性，按照OIE标准测定第25代rChiLaSota-VP2的鸡胚平均致死时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID50)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)致病性指标[19]。

1.7 rChiLaSota-VP2在鸡胚中的生长特性分析将NDV LaSota疫苗株和第25代rChiLaSota-VP2按每胚102EID50的剂量分别接种10日龄SPF鸡胚，在接种后24，48，72，96 h分别收获鸡胚尿囊液，测定EID50，分析LaSota株与rChiLaSota-VP2在鸡胚中的生长特性差异。

2 结果

2.1 带有IBDV VP2基因的重组NDV 感染性克隆的鉴定为了构建表达IBDV流行变异株VP2基因的重组NDV，首先将完整的VP2基因克隆至含有基因Ⅶ型NDV F和HN基因的嵌合型LaSota株全长基因组转录质粒pNDFL-ⅦF/HN中，获得重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2。利用限制性内切酶ApaⅠ和PmlⅠ对pNDFL-ⅦF/HN-VP2进行酶切鉴定，结果显示，重组质粒被切成16 093和2 884 bp 2个预期大小片段(图2)，质粒测序结果也与目的序列相符，证明重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2构建成功。

M.DL15000 DNA Marker；1. 重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2；2. ApaⅠ、PmlⅠ酶切 重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2图2 重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2的酶切鉴定

2.2 表达IBDV变异株VP2基因的重组NDV的拯救与鉴定为了拯救表达IBDV变异株VP2基因的重组NDV，首先用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染BHK-21细胞，然后用pNDFL-ⅦF/HN-VP2和辅助质粒pCIneo-NP-P-L 共转染细胞，转染后96 h，收集细胞上清接种至10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种后120 h收集HA阳性的鸡胚尿囊液，拯救出重组病毒rChiLaSota-VP2。将拯救的重组NDV rChiLaSota-VP2在SPF鸡胚中连续传代10次，提取鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA，利用针对VP2基因插入位点两侧基因序列的特异性引物进行RT-PCR对重组病毒进行鉴定。结果显示，rChiLaSota-VP2模板中能够扩增出重组病毒中包含VP2基因的1 681 bp预期大小片段，而LaSota株对照模板仅能扩增出325 bp预期大小片段(图3)；同时，PCR产物序列的测定结果显示重组病毒中插入的IBDV VP2基因序列正确。

M.DL2000 DNA Marker；1.NDV LaSota株的RT-PCR扩增产物；2.rChiLaSota-VP2的RT-PCR扩增产物图3 重组NDV rChiLaSota-VP2的RT-PCR鉴定

2.3 rChiLaSota-VP2表达IBDV VP2蛋白的鉴定为验证重组病毒rChiLaSota-VP2是否表达IBDV流行变异株的VP2蛋白，将收获的rChiLaSota-VP2和LaSota株感染鸡胚尿囊液进行 SDS-PAGE，然后分别用抗IBDV VP2蛋白单克隆抗体和HRP标记的山羊抗鼠IgG做为第一和第二抗体进行Western blot。图4结果显示，抗IBDV VP2单克隆抗体可以在rChiLaSota-VP2感染鸡胚尿囊液中特异性检测到与IBDV VP2蛋白的理论分子量大小一致的约48 kDa蛋白条带，证明重组NDV rChiLaSota-VP2成功表达IBDV中国流行变异株的VP2 蛋白。

M.预染蛋白质相对分子质量标准；1.重组病毒rChiLaSota-VP2尿囊液； 2.NDV LaSota株尿囊液图4 重组病毒rChiLaSota-VP2表达VP2蛋白的鉴定

2.4 rChiLaSota-VP2的生物学特性分析为了确定将LaSota疫苗株的F和HN基因替换为Ⅶ型NDV的F和HN基因，以及插入IBDV VP2基因是否保留NDV LaSota株的优良生物学特性，本研究参照OIE标准，对第25代rChiLaSota-VP2的生物学特性进行了分析。结果显示，重组NDV rChiLaSota-VP2第25代鸡胚毒的MDT为134 h，ICPI与IVPI均为0，表明重组病毒rChiLaSota-VP2具有与LaSota疫苗株类似的生物学特性，且遗传稳定性良好。

本研究比较了第25代重组NDV rChiLaSota-VP2与LaSota疫苗株在10日龄SPF鸡胚中的复制动态。结果显示， rChiLaSota-VP2与LaSota株保持相近的复制动态，可以在鸡胚上高滴度繁殖，第25代重组NDV rChiLaSota-VP2的EID50最高可达10-8.16/100 μL(图5)。

图5 重组NDV rChiLaSota-VP2与LaSota株在SPF鸡胚中的复制动态比较

3 讨论

近年来由IBDV变异毒株引起的非典型IBD和基因Ⅶ型NDV导致的ND给中国养禽业带来了巨大经济损失。我国目前虽然有用于防控IBD和ND的传统多联灭活疫苗，但尚未有同时防控IBDV变异株和基因Ⅶ型NDV感染的商品化多联疫苗。研发能够同时防控IBDV变异株引起的IBD和基因Ⅶ型NDV所致ND的新型高效、廉价多联疫苗具有重要的现实意义。本研究利用NDV反向遗传学技术平台，在前期成功利用基因Ⅶ型NDV的HN和蛋白酶裂解位点附近氨基酸突变的F基因替换LaSota疫苗株的HN和F基因的基础上，将我国流行的IBDV变异株的VP2抗原基因插入到含有基因Ⅶ型NDV F和HN基因的嵌合型LaSota株全长基因组转录质粒pNDFL-ⅦF/HN中，获得重组质粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2，并成功拯救出表达IBDV变异株VP2蛋白的重组NDV，将为满足我国防控IBD和ND的现实需求奠定基础。

传统的多联疫苗生产需要分别制备多种抗原，生产成本高，工艺繁琐。动物病毒反向遗传学技术的发展为研发廉价多联疫苗提供了契机。基于NDV LaSota株良好的生物安全性和在鸡胚中的高滴度复制特性，国内外利用属于基因Ⅱ型的NDV LaSota疫苗株作为载体构建了表达包括IBDV VP2在内的多种外源基因的基因工程多联疫苗[20-24]。但基于LaSota株的疫苗不能对基因Ⅶ型NDV感染提供良好保护，以及我国鸡群中普遍存在的高水平抗NDV LaSota株母源抗体等因素限制了基于LaSota株的重组活载体疫苗的临床应用。理论上利用致弱的基因Ⅶ型NDV作为载体可以弥补LaSota株载体疫苗的缺陷，但由于目前基因Ⅶ型NDV的致弱局限于通过改变F蛋白的蛋白酶裂解位点附近的几个氨基酸(111～118 aa)来实现[25-26]，因而基于致弱的基因Ⅶ型NDV的载体活疫苗在使用过程中存在与自然毒株同源重组而发生毒力返强的风险，本研究利用改造的基因Ⅶ型NDV的F和HN基因替换LaSota疫苗株的相应基因的策略，不但避免了重组病毒毒力返强的风险，同时又可以提供针对基因Ⅶ型NDV感染的防控，具有明显的特色和优势。我们前期的研究证明，构建的表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组NDV，即可以直接作为二联活疫苗使用，又可以作为制备二联灭活疫苗的种毒，从而实现培养一种病毒，即可制备二联或多联疫苗[27]。本研究结果证明，构建的表达IBDV变异株VP2蛋白的重组rChiLaSota-VP2保留了LaSota 株的安全性和在鸡胚中高滴度复制等生物学特性，提示其可以作为活疫苗使用，从而能够诱导针对IBDV变异株和基因Ⅶ型NDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫等全方位免疫。也可以作为制备新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗的新型种毒，为制备更廉价的二联或多联疫苗奠定基础。

总之，本研究成功构建的表达流行IBDV变异株VP2基因重组病毒rChiLaSota-VP2，将为研发防控IBDV变异株和基因Ⅶ型NDV感染的新型高效、廉价二联和多联疫苗提供新思路，为有效防控IBD和ND提供新的辅助工具。