绝经期复发性尿路感染患者肠道菌群特征及濯淋颗粒的干预作用

朱美凤朱莺王身菊张玲万冰莹陈岱*周春祥

（1.南京中医药大学常州附属医院，江苏 常州213003； 2.南京中医药大学常熟附属医院，江苏 常熟215500； 3.南京中医药大学，江苏 南京210046）

复发性尿路感染是指半年内发作≥2次，或1 年内发作≥3 次的尿路感染，具有反复发作、难以根治的特点。绝经期女性随着年龄的增长，泌尿生殖系统逐渐发生退行性变和功能减退，发生复发性尿路感染的风险增加［1-2］。抗菌药物预防已被证明在降低女性复发性尿路感染的风险方面有效，但会诱导致病微生物和本地菌群产生耐药性［2］。

研究发现，肠源性细菌上行是发生尿路感染的始动因素［3-5］。Ghalavand等［3］从63 名症状性尿路感染患者的粪便和尿液样本中分离出粪肠球菌，RAPD-PCR、PFGE 分析显示分别有26.9%、15.8%的同一个体成对粪肠球菌之间的分子指纹图谱模式相同，证实了肠道内定植细菌污染引起的内源性感染；Magruder等［4］报道，1%肠道大肠杆菌和肠球菌相对丰度是发生肠杆菌尿路感染和肠球菌尿路感染的独立危险因素，提出了“肠道菌群-UTI 轴”的观念。肠道菌群失衡可能与绝经期女性发生复发性尿路感染的风险相关，但目前尚无揭示绝经期复发性尿路感染患者的肠道菌群特征的报道。

濯淋颗粒是南京中医药大学常州附属医院张志坚教授临床经验方，具有解郁濯淋的功效，对绝经期复发性尿路感染疗效确切，能提高肝郁湿热证复发性尿路感染患者治愈率，改善临床症状，降低复发率［6］。为此，本研究在前期报道基础上，进一步观察绝经期复发性尿路感染患者肠道菌群特征，以及濯淋颗粒的干预作用，以期从肠道微生态角度探讨濯淋颗粒防治复发性尿路感染的机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2019 年1 月6 月南京中医药大学常州附属医院肾病科门诊治疗的16 例绝经期复发性尿路感染患者，随机分为中药组、西药组，每组8例，同期本院健康体检人群8 例为健康对照组。研究经南京中医药大学附属常州市中医医院伦理委员会批准［批件号2018-LL-02（L）］。

1.2 诊断、纳入、排除标准

1.2.1 诊断标准 参照《尿路感染诊断与治疗中国专家共识（2015 版）——尿路感染抗菌药物选择策略及特殊类型尿路感染的治疗建议》［7］制定，即尿路感染（尿频、急、痛中至少存在2 个症状，中段尿培养菌落计数≥1.0×105cfu／mL）6 个月内发作≥2次，或1 年内发作≥3 次。

1.2.2 纳入标准 ①年龄45～80 周岁，女性；②生理性绝经1 年以上；③符合“1.2.1”项下诊断标准；④近3 个月内未使用抗生素、微生态制剂；⑤自愿参与本研究，并签署知情同意书。

1.2.3 排除标准 ①复杂性尿路感染；②由真菌、支原体、衣原体、寄生虫等引起的尿路感染；③合并严重心、肝、肾、造血系统、呼吸系统、内分泌系统等疾病，以及恶性肿瘤或影响其生存的严重疾病；④精神不健全；⑤3个月内使用过抗生素、微生态制剂；⑥对本研究药物过敏；⑦正在参加其他临床研究。

1.3 治疗方法 中药组口服濯淋颗粒，由乌药10 g、青皮10 g、木香10 g、川楝子10 g、柴胡10 g、炒栀子10 g、滑石10 g、车前草15 g、瞿麦10 g、赤芍10 g、川断10 g、桑寄生10 g、甘草3 g 组成，每天1剂，共400 mL，分早、晚2 次开水冲服；西药组根据中段尿培养药敏试验结果，选用敏感抗生素口服，包括左氧氟沙星胶囊（扬子江药业有限公司，国药准字H19990051）、头孢丙烯（扬子江药业有限公司，国药准字H20061246）、呋喃妥因肠溶片（常州康普药业有限公司，国药准字H32021349）、法罗培南（鲁南贝特制药有限公司，国药准字H20060977），常规剂量口服2 周后，改为每晚1粒，2 组患者均连续治疗4 周。治疗前后，检测患者血常规、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐，进行安全性评价。

1.4 标本采集 复发性尿路感染组［治疗前0～2 d、治疗（28±2）d］、健康对照组（入组后）采集粪便标本。患者排空小便后，准备好便盆和粪便采集管，洗手，带上手套收集新鲜的粪便标本200～500 mg，放入无菌EP管，做好标记，标本采集后置于4 ℃冰盒中，30 min 内运回实验室，置于-80 ℃冰箱中冻存待用。采集、运送样本过程严格按照无菌操作规范进行。

1.5 粪便DNA 提取、扩增及测序 采用E.Z.N.A.粪便DNA 试剂盒（美国Omega Biotek 公司）对样本基因组DNA 进行提取。选择16 S rDNA 的V3～V4 高变区作扩增和测序目的片段，引物序列为 341F（正 向）CCTACGGGNGGCWGCAG，806R（反 向）GGACTACHVGG GTATCTAAT。PCR 反应体系为50 μL 混合物，包括100 ng模板DNA、1 μL KOD 聚合酶、5 μL 10×OD缓冲液、5 μL 2.5 mmol／L dNTPs、1.5 μL 引物（每种5 μL）；PCR 反应条件为95 ℃预变性2 min，98 ℃10 s，62 ℃30 s，68 ℃30 s，27个循环，68 ℃ 10 min。PCR 扩增产物切胶回收，用QuantiFluor TM 荧光剂进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序，纯化和定量后对PCR 产物进行测序，对照Silva数据库进行物种注释和分类。文库构建与测序工作由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.6 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用KW 秩和检验，R 语言绘制物种累积曲线。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 复发性尿路感染组、健康对照组年龄、BMI、绝经年限，以及中药组、西药组年龄、BMI、绝经年限、既往尿路感染发作次数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗4 周后，中药组5 例、西药组4 例完成粪便采集。见表1～2。

表1 复发性尿路感染组、健康对照组一般资料比较（）

表1 复发性尿路感染组、健康对照组一般资料比较（）

表2 中药组、西药组一般资料比较（， n＝8）

表2 中药组、西药组一般资料比较（， n＝8）

2.2 物种累积曲线分析 经OTUs 聚类后，从粪便样品中随机抽取一定测序量的数据构建物种累积曲线以评估抽样是否充分和粪便样品的丰富度。结果显示，33 个粪便样本的曲线急剧上升后趋于平缓，表明抽样充分，扩大样本量不会增加新物种，见图1。

图1 粪便样本物种累积曲线

2.3 OTU 分析 复发性尿路感染组、健康对照组共有OTUs 为499个，前者OTU 数目少于后者（672个vs858个），见图2。OTU 主成分分析显示，PC1 值为29.00%，PC2 值为11.92%，健康对照组粪便样品在PCA 图中的分布相对集中，而复发性尿路感染组相对分散，前者相似度高于后者，见图3。

图2 肠道菌群Venn图

图3 肠道菌群PCA图

2.4 肠道菌群多样性分析 复发性尿路感染组肠道菌群的sobs 指数低于健康对照组（702.187 5vs823.875 0）（P＜0.05），提示复发性尿路感染患者肠道菌群α 多样性降低，见图4。同时，PCo1、PCo2 分别为31.98%、14.19%，复发性尿路感染组、健康对照组在PCoA 图上各自聚类，又有部分重叠，2 类人群肠道菌群β 多样性存在显著差异（P＜0.01），见图5。

图4 肠道菌群sobs 指数

图5 肠道菌群PCoA图

2.5 肠道菌群结构变化 见图6～8、表3。在门分类水平上，①健康对照组主要优势菌门为厚壁菌门＞拟杆菌门＞疣微菌门＞变形菌门，而复发性尿路感染组主要优势菌门为拟杆菌门＞厚壁菌门＞变形菌门＞放线菌门，后者拟杆菌门丰度高于前者（P＜0.05），厚壁菌门丰度、厚壁菌门与拟杆菌门比值（F／B）、疣微菌门丰度更低（P＜0.05）；②治疗后，中药组拟杆菌门丰度下降，厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门丰度及F／B 升高，而西药组拟杆菌门、疣微菌门丰度上升，厚壁菌门、变形菌门丰度及F／B 下降；③治疗后，2 组肠道菌群相对丰度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 中药组、西药组、健康对照组肠道菌群相对丰度比较（%）

图6 肠道菌群在门水平上分布

图7 肠道菌群在属水平上分布

图8 各组肠道样品OTU 分布的Venn图

在属分类水平上，①健康对照组主要优势菌属为拟杆菌属＞Akkermansia＞Phascolarctobacterium＞Dialister，而复发性尿路感染组主要优势菌属为拟杆菌属＞罕见小球菌属（Subdoligranulum）＞大肠杆菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）＞Phascolarctobacterium，后者拟杆菌属丰度高于前者（P＜0.05），Akkermansia、另枝菌属（Alistipes）、Dialister、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属丰度更低（P＜0.05）；②治疗后，中药组拟杆菌属、罕见小球菌属丰度下降，乳杆菌属、大肠杆菌-志贺菌属丰度上升，而西药组罕见小球菌属、乳杆菌属、大肠杆菌-志贺菌属丰度下降；③治疗后，2 组肠道菌群相对丰度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

复发性尿路感染属于中医“淋证”范畴，临床证候与肝经密切相关。《灵枢·经脉》云“是主肝所生病者……遗溺闭癃”。绝经期复发性尿路感染，或因郁致病，或因病致郁，两者互为因果［8］。情志失和，肝失其用，疏泄失职，气滞湿阻，溲溺约利失节；湿热之邪循经下注，湿热、郁热胶着，淋证缠绵难愈。近年来多项研究报道，粪便移植可以降低复发性尿路感染的复发率。因此，调节肠道菌群可能是中医药防治绝经期复发性尿路感染的新策略［9-12］。

濯淋颗粒功能解郁、濯淋，在临床治疗绝经期复发性尿路感染取得了良好疗效［6］。方中乌药入厥阴肝经，行气止痛、温肾散寒，木香性温、味辛苦，功可行气止痛，又可理气健脾；《妇人良方》 云“若肝经气滞，用四君、青皮柴胡”，青皮味苦辛，色清气烈，主气滞、破积结，入肝散结，柴胡味苦辛，归肝经，疏肝理气，以柴胡、青皮疏化而利。川楝子苦寒清热，长于疏肝止痛，栀子性寒、味苦，泻火除烦、清热利尿，滑石味甘淡、性平，利尿通淋，车前草、瞿麦具有清热解毒、利尿；赤芍味苦，性微寒，归肝经，具有活血行气、化瘀通络；绝经期女性，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，肾精亏虚，加入川断、桑寄生以补肾，扶正以祛邪。甘草味甘性平，能调和诸药。诸药合用扶正祛邪兼施。现代药理已经证明，栀子对肠杆菌、肠球菌有较强的抑制作用［13］；车前草种子多糖可以提升小鼠结肠菌群多样性，拟杆菌属、真杆菌属、Butyrivibrio sp.、双歧杆菌、发酵乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属丰度［14］；甘草总皂苷可以提高肝损伤大鼠肠道菌群乳杆菌属的相对丰度［15］。

本研究通过对16 例绝经期复发性尿路感染患者和8 例健康对照者进行肠道细菌16 S rDNA 的V3～V4 可变区扩增、测序。结果表明，复发性尿路感染组肠道菌群的多样性低于健康对照组，乳杆菌属丰度低于健康对照组，两组肠道菌群结构存在差异。濯淋颗粒可以调节厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门的相对丰度，提高F／B 比值，表明濯淋颗粒可以重建肠道菌群平衡。濯淋颗粒治疗后乳杆菌属相对丰度增加，表明濯淋颗粒干预可能增加乳杆菌属的丰度，对肠道菌群产生了积极效应。就条件致病菌而言，濯淋颗粒治疗4 周后，变形杆菌、大肠杆菌-志贺菌属较治疗前增加但没有统计学意义，表明濯淋颗粒对条件致病菌影响较小。而抗生素组治疗后乳杆菌属丰度下降。

抗生素治疗尿路感染强调杀灭病原菌，会引起肠道菌群紊乱，反而导致感染的风险增加。濯淋颗粒可以增加肠道有益菌，重新建立肠道微生态平衡，体现了中医“阴平阳秘”的核心思想。本研究中药组、西药组在治疗后肠道菌群差异比较无统计学意义，考虑与观察周期短有关。

本研究初步研究了绝经期复发性尿路感染女性患者的肠道菌群特征，并初步探讨了濯淋颗粒对肠道菌群的影响，推测濯淋颗粒可以重建肠道菌群平衡。但因条件限制，本研究是一项基于少数样本的研究，且设计粗浅，有待进一步深入研究与验证。